„Präzises De-novo-Design von hochaffinen Proteinbindungsmakrozyklen mittels Deep Learning“
Heute stellen wir einen Forschungsartikel der Teams von David Baker und Gaurav Bhardwaj vor, der in Nature Chemical Biology veröffentlicht wurde. In dieser Studie wurde RFpeptides entwickelt, eine generative KI-Pipeline auf Basis von Rauschunterdrückung und Diffusion, die das De-novo-Design makrozyklischer Peptide ermöglicht. Dies geschieht durch die Integration des Strukturvorhersagenetzwerks RoseTTAFold2 (RF2) und des Frameworks RFdiffusion zur Generierung von Proteinrückgraten. Die Arbeit ermöglicht erstmals das präzise Design hochaffiner makrozyklischer Peptidbinder, die mehrere Proteinziele adressieren. Die Validierung erfolgte mittels Röntgenkristallographie, die eine hohe Übereinstimmung zwischen den entworfenen und experimentellen Strukturen zeigt (Cα RMSD
01 Forschungshintergrund
Makrozyklische Peptide bergen großes Potenzial als Therapeutika und schließen die Lücke zwischen niedermolekularen Substanzen und großen Biologika: Sie vereinen die Zellmembranpermeabilität niedermolekularer Substanzen mit der hohen Affinität und Selektivität von Biologika. Die traditionelle Entdeckung makrozyklischer Peptide basiert jedoch auf dem Screening von Naturstoffen oder groß angelegten Substanzbibliotheken (z. B. Phagen-Display), welche ressourcenintensiv und zeitaufwändig sind und nur eine begrenzte Kontrolle über den Bindungsmodus bieten. Trotz Fortschritten im Proteindesign können bestehende computergestützte Methoden (z. B. physikbasiertes Design oder Sprachmodelle) kein robustes De-novo-Design von makrozyklischen Peptidbindern ermöglichen, insbesondere wenn keine bekannten Bindungspartner oder vordefinierten Motive vorliegen. Zu den größten Herausforderungen zählen die kombinatorische Vielfalt des Sequenzraums makrozyklischer Peptide, komplexe Struktur-Wirkungs-Beziehungen und die Notwendigkeit, mehrere Eigenschaften wie Bindungsaffinität, Selektivität und Permeabilität gleichzeitig zu optimieren. Daher ist die Entwicklung einer computergestützten Methode, die präzise hochaffine makrozyklische Peptidbinder generieren kann, von entscheidender Bedeutung.
02 Innovative Highlights
Erste auf einem Diffusionsmodell basierende Pipeline zur Generierung makrozyklischer Peptide: RFpeptides kombiniert das Diffusionsframework von RFdiffusion mit der Fähigkeit von RF2 zur Vorhersage von Proteinstrukturen und führt eine zyklische relative Positionskodierung ein. Dadurch ist das Modell in der Lage, makrozyklische Peptidgerüste direkt in einem kontinuierlichen Einbettungsraum zu generieren, ohne einen latenten Raum vorab trainieren oder auf bekannte Bindungsmotive zurückgreifen zu müssen.
Tiefe Integration von Sequenzdesign und Strukturoptimierung: Die Pipeline verwendet ProteinMPNN für das Sequenzdesign in Kombination mit Rosetta Relax für die Strukturoptimierung. Dadurch wird sichergestellt, dass die generierten Peptidsequenzen mit den Rückgraten kompatibel sind und gleichzeitig die Anforderungen der Bindungsschnittstelle und der physikochemischen Eigenschaften erfüllen.
Umfassende Validierung und hochpräzise Strukturübereinstimmung: Aus einer großen Anzahl generierter Peptide wurde eine kleine Anzahl von Kandidaten (≤ 20 pro Zielprotein) für die Synthese und experimentelle Prüfung ausgewählt. Dies führte zu Bindern mit mittlerer bis hoher Affinität gegen vier verschiedene Proteinziele (MCL1, MDM2, GABARAP und RbtA). Die Röntgenkristallographie bestätigte eine hohe Übereinstimmung zwischen den entworfenen und experimentellen Strukturen (Cα RMSD
03 Ergebnisse und Diskussion
3.1 Computergestützter Rahmen und Eigenschaften der generierten Peptide
Die RFpeptides-Pipeline arbeitet in drei Schritten: Zunächst werden makrozyklische Peptidgerüste mittels modifizierter RFdiffusion generiert. Anschließend werden Aminosäuresequenzen mit ProteinMPNN entworfen. Abschließend erfolgt die Filterung anhand komplexer Strukturen, die mit AfCycDesign oder RoseTTAFold vorhergesagt werden. Die generierten Peptide weisen eine hohe Diversität der Gerüste auf und ihre physikochemischen Eigenschaften ähneln denen natürlicher makrozyklischer Peptide. Die Natürlichkeit der Sequenzen (bewertet durch die ProGen2-Perplexität) unterscheidet sich nicht signifikant vom Trainingsdatensatz (Trainingsdatensatz PPL = 17,93 vs. generierter Datensatz PPL = 17,90). Die ausgewählten Peptide sind mit Schlüsselresten wie Lysin (K), Leucin (L) und Arginin (R) angereichert, was ihre Kationizität und Amphipathie erhöht und somit ihr Membran-Targeting-Potenzial optimiert.
Abb. 1. RFpeptides ist ein diffusionsbasiertes Verfahren zur De-novo-Entwicklung von proteinbindenden Makrozyklen.
3.2 Neuentwicklung für MCL1 und MDM2
Für die Proteinziele MCL1 (Myeloid Cell Leukemia 1) und MDM2 (p53-regulierendes Protein) generierten RFpeptide Tausende makrozyklischer Peptidgerüste, die mithilfe einer Kombination aus AfCycDesign-Vorhersagen und Rosetta-Schnittstellenmetriken gefiltert wurden. Für MCL1 konnten 14 von 27 entworfenen Peptiden erfolgreich synthetisiert werden, von denen 3 Bindungsaktivität zeigten. Der beste Binder, MCB_D2, wies eine Dissoziationskonstante (Kd) von 2 µM auf. Die Röntgenkristallstruktur (2,1 Å Auflösung) zeigte eine hohe Übereinstimmung mit der experimentellen Struktur (Cα RMSD = 0,7 Å). Die Bindungsschnittstelle umfasste helikale und Schleifenregionen, einschließlich Kation-π-Wechselwirkungen, die bei natürlichen Bindern nicht beobachtet wurden.
Abb. 2. Neuentwicklung und Charakterisierung makrozyklischer Bindemittel für MCL1 und MDM2.
3.3 Entwicklung hochaffiner Bindemittel für GABARAP
Für das GABAA-Rezeptor-assoziierte Protein (GABARAP) entwarf RFpeptides 80.000 Kandidatenpeptide, von denen 13 verschiedene Peptide mittels Clustering für experimentelle Tests ausgewählt wurden. Sechs Peptide wurden erfolgreich synthetisiert, wobei GAB_D8 und GAB_D23 Affinitäten im nanomolaren Bereich aufwiesen (Kd = 6 nM bzw. 36 nM). Ihre Wirksamkeit bei der Hemmung der GABARAP-K1-Peptid-Interaktion wurde mittels AlphaScreen validiert (IC50 = 0,7 nM bzw. 2,5 nM). Röntgenstrukturanalysen zeigten eine hohe Übereinstimmung zwischen den entworfenen und experimentellen Strukturen (Cα RMSD = 1,2 Å für GAB_D8 und 1,7 Å für GAB_D23). Der Bindungsmodus umfasste β-Faltblatt- und Helixstrukturen, was die Anpassungsfähigkeit der Methode an verschiedene Taschenformen demonstriert.
Abb. 3. Neuentwicklung von hochaffinen Makrozyklusbindern für GABARAP.
3.4 Design, das auf die vorhergesagte Struktur von RbtA abzielt
Für Rhombotarget A (RbtA) aus Acinetobacter baumannii (für das keine experimentelle Struktur vorliegt) nutzte RFpeptides AF2 und RF2, um die Zielstruktur vorherzusagen und makrozyklische Peptidbinder zu entwerfen. Aus 20.000 generierten Peptidgerüsten wurden 26 Kandidatenpeptide ausgewählt, wobei RBB_D10 eine hohe Affinität (Kd = 9,4 nM) aufwies. Die Röntgenkristallographie bestätigte eine hohe Übereinstimmung zwischen den vorhergesagten und experimentellen Zielstrukturen (Cα RMSD = 1,2 Å), und die Komplexstruktur entsprach dem Designmodell (Cα RMSD = 1,4 Å), was die Präzision der Methode auch für vorhergesagte Zielstrukturen belegt.
Abb. 4. Präzises De-novo-Design eines hochaffinen cyclischen Peptidbinders basierend auf der vorhergesagten Struktur von RbtA aus A. baumannii.
04 Schlussfolgerung und Zukunftsperspektiven
Die in dieser Studie entwickelte RFpeptides-Pipeline stellt einen bedeutenden Durchbruch im Bereich des makrozyklischen Peptiddesigns dar. Ihr Kernwert liegt in der tiefen Integration von generativer KI und Strukturvorhersage, die das vollautomatische Design hochaffiner Peptide aus Zielsequenzen oder -strukturen ermöglicht. Experimentelle Validierungen zeigen, dass diese Methode hochaktive und spezifische Binder für diverse Zielstrukturen (einschließlich solcher mit flachen Bindungsflächen) generieren kann, mit einer hohen Übereinstimmung zwischen designten und experimentellen Strukturen und einer Erfolgsrate von 76 % (35 von 46 getesteten Peptiden waren aktiv). Zukünftige Arbeiten könnten die bedingte Generierung (z. B. für spezifische Epitope), den Einbau nicht-kanonischer Aminosäuren und Zyklisierungsreaktionen sowie die Anwendung auf ein breiteres Spektrum therapeutischer Zielstrukturen (z. B. Membranproteine oder Protein-Protein-Interaktionsflächen) umfassen. RFpeptides bietet eine skalierbare Plattform zur Beschleunigung der Peptidwirkstoffentwicklung und birgt vielversprechende Möglichkeiten für die Weiterentwicklung der Präzisionsmedizin und der Therapie von Infektionskrankheiten.
Originalartikel:
Rettie SA, Juergens D, Adebomi V, Bueso YF, Zhao Q, Leveille AN, Liu A, Bera AK, Wilms JA, Üffing A, Kang A, Brackenbrough E, Lamb M, Gerben SR, Murray A, Levine PM, Schneider M, Vasireddy V, Ovchinnikov S, Weiergräber OH, Willbold D, Kritzer JA, Mougous JD, Baker D, DiMaio F, Bhardwaj G. Präzises De-novo-Design von hochaffinen Proteinbindungsmakrozyklen mittels Deep Learning. Nat Chem Biol. 2025 Jun 20.