Kontrollierte Cyclisierung trifft auf ribosomale Synthese: Die Geburtsstunde einer neuen Generation bicyclischer Peptidplattformen

Heute stellen wir Ihnen eine wichtige Studie des Teams um Professor Hiroaki Suga von der Universität Tokio vor, die in der Angewandten Chemie International Edition unter dem Titel „Ribosomale Synthese topologisch definierter, Thioisoindol-verbrückter bicyclischer Peptide“ veröffentlicht wurde. In dieser Studie wurde eine neuartige Synthesestrategie für bicyclische Peptide auf Basis von Thioisoindol-Brücken entwickelt. Durch die Verwendung einer semicarbazongeschützten 2-Nicotinylbenzaldehyd-Aminosäure (Ac-Ala(NtBA)Sc-CME) als Translationsinitiator konnte diese mithilfe eines flexiblen In-vitro-Translationssystems (FIT) effizient in Peptidketten eingebaut werden. Anschließend löste eine milde Säurebehandlung eine intramolekulare Bicyclisierungsreaktion aus, wodurch strukturell präzise bicyclische Peptide erfolgreich synthetisiert wurden. Diese Methode ist vollständig kompatibel mit der mRNA-Display-Technologie und bietet eine leistungsstarke Plattform für den Aufbau umfangreicher, topologisch definierter Bibliotheken bicyclischer Peptide zur Wirkstoffforschung.

Abbildung 1. Schematische Übersicht dieser Studie: ribosomale Konstruktion von Thioisoindol-verbrückten bicyclischen (TiB) Peptiden.

01 Forschungshintergrund

Makrozyklische Peptide haben sich aufgrund ihrer starren Strukturen und ihrer hohen Zielgenauigkeit zu einem wichtigen Grundgerüst in der Wirkstoffforschung entwickelt. Traditionelle Methoden zur Erstellung von Bibliotheken makrozyklischer Peptide (z. B. Disulfid-Cyclisierung) weisen jedoch eine geringe metabolische Stabilität und begrenzte strukturelle Diversität auf. Obwohl die mRNA-Display-Technologie das Screening von extrem großen Bibliotheken (>10^12) ermöglicht, gelingt es mit bestehenden Cyclisierungsstrategien (hauptsächlich basierend auf nukleophilen Angriffen von Cystein oder der Bildung von Disulfidbrücken) nur schwer, strukturell stabile, topologisch definierte bizyklische Peptide zu generieren. Die Ortho-Phthalaldehyd-(OPA)-Chemie ermöglicht zwar die Cyclisierung über die Bildung von Thioisoindol-Strukturen, ihre hohe Reaktivität führt jedoch häufig zu unspezifischen Nebenreaktionen und ist nicht direkt auf In-vitro-Translationssysteme anwendbar. Daher besteht ein dringender Bedarf an einer neuen, mit dem mRNA-Display kompatiblen Methode, die eine hohe Kontrollierbarkeit aufweist und stabile bizyklische Strukturen generieren kann.

02 Innovative Highlights

• Entwicklung eines neuartigen Translationsinitiators mit einstellbarer Reaktivität:

Das Forschungsteam synthetisierte drei Phenylalanin-Analoga (AcBA, NtBA, BzBA) auf Basis von 2-Ketobenzaldehyd. Durch die Einführung von Substituenten (z. B. Nicotinoyl) zur Reduzierung der Reaktivität der OPA-Einheit wurden Nebenreaktionen mit freien Komponenten im Translationssystem vermieden. Gleichzeitig wurde eine Semicarbazon-Gruppe als reversible Schutzgruppe eingesetzt, um die Stabilität des Initiators während der Translation zu gewährleisten und eine selektive Abspaltung durch milde Säurebehandlung nach der Translation zur Auslösung der Cyclisierung zu ermöglichen.

• Etablierung eines effizienten Negishi-Kopplungspfads:

Durch Optimierung der Bedingungen der Palladium-katalysierten Negishi-Kreuzkupplung (Pd₂(dba)₃/SPhos-System) gelang es dem Team, die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung ohne Schutz der Aldehydgruppe herzustellen und das Schlüsselintermediat Ac-Ala(NtBA)CHO-OMe in 67% Ausbeute unter Erhalt der chiralen Reinheit zu synthetisieren. Diese Methode eröffnet einen neuen Syntheseweg für analoge Strukturen.

• Realisierung der ribosomalen „Eintopf“-Synthese von bicyclischen Peptiden:

Der optimale Initiator Ac-Ala(NtBA)Sc-CME wurde effizient mittels Flexizym auf tRNA geladen und mithilfe des FIT-Systems am N-Terminus der Peptidkette eingebaut. Nach der Translation vervollständigte die gleichzeitige Zugabe eines Citratpuffers (pH 4) und Pyruvat die Semicarbazon-Deprotektion und intramolekulare Bicyclisierung, wodurch eine 3-(Pyridin-3-yl)-1-thioisoindol-verbrückte bicyclische Struktur entstand.

03 Ergebnisse und Diskussion

3.1 Initiatordesign und synthetische Optimierung

Durch rationales Design modifizierte das Team die OPA-Struktur zu 2-Nicotinoylbenzaldehyd (NtBA), wodurch dessen Elektrophilie deutlich reduziert wurde, und führte gleichzeitig die Semicarbazon-Schutzgruppe ein, um die Translationskompatibilität zu gewährleisten (Abbildung 2).

Abbildung 2. a) Design des Dicarbonyl-Phenylalanin-(2CO-Phe)-Derivats für die Flexizym-vermittelte Aminoacylierung. b) Schematische Darstellung der ribosomalen Synthese von Thioisoindol-verbrückten bicyclischen (TiB) Peptiden unter Verwendung eines designten Translationsinitiators in einem genetisch reprogrammierten FIT-System.

3.2 Effiziente Aminoacylierung des Translationsinitiators

Flexizym-vermittelte tRNA-Beladungsexperimente zeigten, dass Ac-Ala(NtBA)Sc-CME bei einer Konzentration von 25 mM eine nahezu quantitative Beladungseffizienz erreichte (Abbildung 3) und damit den üblicherweise verwendeten Initiator ClAc-Trp übertraf. Dies beweist seine Wirksamkeit als hocheffizientes Substrat für die Translationsinitiierung.

Abbildung 3. a) Synthese des zentralen Substrats 1, Ac-Ala(NtBA)Sc-CME. b) Optimierung der Negishi-Kreuzkupplungsbedingungen, wobei die finalen Kupplungsbedingungen hervorgehoben sind. c) Chemische Strukturen der Verbindungen 7 und 8.

3.3 Optimierung der Zyklisierungsbedingungen und Überprüfung der mRNA-Kompatibilität

Screening-Untersuchungen ergaben, dass ein 50 mM Citratpuffer (pH 4), der 1 mM Pyruvat enthielt, die Cyclisierung bei 37 °C effizient auslöste. Darüber hinaus blieb unter diesen Bedingungen die mRNA-Integrität erhalten (Abbildung 4), wodurch die Anforderungen für die mRNA-Darstellung erfüllt wurden.

Abbildung 4. a) Schematische Übersicht der ribosomalen Synthese des TiB-Peptids ck1; die rechte Abbildung zeigt die entsprechenden LC/MS-Extraktionsionenstrom-Chromatogramme (EIC) und Massenspektren.

3.4 Allgemeine Konstruktion von bicyclischen Peptidbibliotheken

Die Untersuchung von 14 Templates mit unterschiedlichen Sequenzen (variabler Cystein/Lysin-Abstand) führte zur erfolgreichen Umwandlung von 12 in bicyclische Peptide mit Umwandlungsraten zwischen 60 % und 98 % (Abbildung 5). Die Ergebnisse zeigen, dass die Cyclisierungseffizienz unabhängig von der Sequenzlänge und der Aminosäureanordnung ist, was die Robustheit der Strategie belegt.

Abbildung 5. a) und b) Repräsentative Sequenzen von ribosomal synthetisierten Thioisoindol-bicyclischen (TiB) Peptiden.

04 Schlussfolgerung und Zukunftsperspektiven

Diese Studie entwickelte erfolgreich eine neue Methode zur ribosomalen Synthese von Thioisoindol-verbrückten bicyclischen Peptiden. Durch die Entwicklung eines Translationsinitiators mit einstellbarer Reaktivität und milder posttranslationaler Cyclisierung wurde die effiziente und programmierbare Synthese topologisch definierter bicyclischer Peptide erreicht. Diese Strategie überwindet die Stabilitäts- und Kompatibilitätsbeschränkungen traditioneller Cyclisierungsmethoden und lässt sich nahtlos in die mRNA-Display-Technologie integrieren. Zukünftig könnte die Integration von Reinigungs-Tags in den Initiator die Qualität der Bibliothek weiter verbessern, oder der Ansatz könnte auf die Konstruktion anderer stabiler cyclischer Strukturen (z. B. Thiazolinbrücken) erweitert werden. Diese Arbeit bereichert nicht nur die chemische Diversität von Peptidbibliotheken, sondern bietet auch ein neuartiges Werkzeug zur Entdeckung von Liganden, die auf bisher als „nicht medikamentös angreifbare“ Proteine ​​abzielen.