Pfropfung von Imidazopyridinium-Heterocyclen zur Verbesserung der Membranpermeabilität von cyclischen Peptiden

Dieses Mal stellen wir eine Studie vor, die in der Zeitschrift veröffentlicht wurde. Zeitschrift der Amerikanischen Chemischen GesellschaftDie Forschungsarbeit mit dem Titel „Synthese membrangängiger makrozyklischer Peptide mittels Imidazopyridinium-Pfropfung“ unter der Leitung des Teams von Thomas Kodadek befasst sich mit einem zentralen Problem in der klinischen Anwendung makrozyklischer Peptide (MPs) – deren geringer Zellmembranpermeabilität – und entwickelt hierfür eine neuartige Festphasensynthesestrategie. Diese Methode ermöglicht die effiziente Herstellung makrozyklischer Strukturen mit einer Imidazopyridinium-Einheit durch Abfangen eines intramolekularen Imin-Zwischenprodukts und dessen Umsetzung mit 2-Formyl- (oder 2-Keto-)pyridin. Diese Methode eignet sich nicht nur zur Synthese makrozyklischer Peptide unterschiedlicher Größe und Geometrie (Kopf-Seitenketten-, Seitenketten-Seitenketten-Verknüpfung), sondern – und das ist entscheidend – die resultierenden IP⁺-haltigen makrozyklischen Peptide weisen eine außergewöhnliche passive Membranpermeabilität auf, die die Erwartungen an Moleküle, die der „Fünferregel“ folgen, weit übertrifft. Die Studie zeigt darüber hinaus, dass sich diese Methode für die Erstellung von Bibliotheken makrozyklischer Peptide eignet und erfolgreich Proteinliganden identifiziert. Sie bietet somit eine leistungsstarke neue Plattform für die Entwicklung makrozyklischer Peptidmedikamente, die auf intrazelluläre Zielstrukturen abzielen.

01 Forschungshintergrund

Makrozyklische Peptide (MPs) haben als Sonden und Leitstrukturen für das Targeting schwer zugänglicher Proteine ​​(z. B. mit flachen Bindungstaschen) große Aufmerksamkeit erlangt. Obwohl verschiedene effiziente Technologien zur Synthese und zum Screening von Bibliotheken makrozyklischer Peptide existieren (z. B. Phagen-Display, mRNA-Display, DNA-kodierte Bibliotheken), ist ihre klinische Anwendung aufgrund geringer Zellmembranpermeabilität und Bioverfügbarkeit weiterhin eingeschränkt. Gängige Strategien zur Verbesserung der Membranpermeabilität umfassen die Nachahmung von Naturstoffen wie Cyclosporin durch „Verbergen“ der Peptidbindungspolarität mittels N-Methylierung oder durch die Bildung intramolekularer Wasserstoffbrückenbindungen. Es besteht jedoch weiterhin ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuartiger Makrozyklisierungsreaktionen, die unter milden Bedingungen effizient sind, neue funktionelle Gruppen einführen und gleichzeitig eine hohe Membranpermeabilität gewährleisten. Die Imidazopyridinium-(IP⁺)-Gruppe, ein permanent positiv geladener, aber hydrophober aromatischer Heterocyclus, bietet vielversprechende Möglichkeiten zur Erleichterung des Transmembrantransports durch elektrostatische Anziehung und hydrophobe Wechselwirkungen. Ziel dieser Studie ist es, die Verwendung von IP⁺-Bildungsreaktionen zur effizienten Synthese makrozyklischer Peptide zu untersuchen und deren revolutionären Einfluss auf die Verbesserung der Peptidmembranpermeabilität systematisch zu bewerten.

02 Innovative Highlights

2.1 Cyclisierungsmethode: Erste Einführung der IP⁺-Einheit in makrozyklische Peptide, Entwicklung einer neuen effizienten Festphasensynthesereaktion

Diese Arbeit stellt erstmals eine neuartige Makrozyklisierungsstrategie vor und validiert sie: Die N-terminale Glycolaldehyd-Einheit (erzeugt durch NaIO₄-Oxidation von Serin) wird an eine festphasensynthetisierte Peptidkette gebunden, um mit dem ε-Amin eines Lysins in der Seitenkette ein intramolekulares Imin zu bilden. Dieses Imin wird anschließend mit 2-Formylpyridin (oder dessen Derivaten) abgefangen, wodurch in einem Schritt ein stabiler, Imidazopyridinium-verbrückter Ring entsteht. Die Reaktionsbedingungen sind mild (50 % AcOH/TFE, 30 °C), die Ausbeuten hoch (oft nahezu quantitativ) und intermolekulare Nebenreaktionen minimal, wodurch sich die Methode optimal für die Festphasensynthese eignet.

2.2 Leistungsdurchbruch: IP⁺-makrozyklische Peptide weisen eine bahnbrechend hohe passive Membranpermeabilität auf

Systematische Untersuchungen mittels des Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA) zeigten, dass etwa 45 % der synthetisierten IP⁺-makrozyklischen Peptide (Molekulargewicht 650–850 Da) eine exzellente passive Membranpermeabilität aufwiesen, mit Permeationsraten, die mit denen traditioneller niedermolekularer Arzneistoffe (z. B. Propranolol) vergleichbar waren. Selbst makrozyklische Peptide mit Molekulargewichten über 1000 Da zeigten eine moderate Permeabilität. Vergleichsexperimente (Ersetzen der IP⁺-Brücke durch neutrale Linker wie Amid oder Thioether) bestätigten, dass die IP⁺-Einheit selbst der Schlüsselfaktor für die extrem hohe Membranpermeabilität ist. Ihre permanente positive Ladung und ihre hydrophobe aromatische Struktur fördern wahrscheinlich synergistisch die Membranassoziation und den Transmembrantransport.

2.3 Anwendung: Nachweis der Eignung für die Erstellung von Hochdurchsatzbibliotheken und das Ligandenscreening

In der Studie wurden erfolgreich 100 IP⁺-makrozyklische Peptide parallel im Mikromaßstab (2 mg Harz/Well) in einer 96-Well-Mikrofilterplatte synthetisiert, wobei die meisten Produkte eine Reinheit von >85 % erreichten. Dies belegt die Anwendbarkeit der Methode für die Erstellung kombinatorischer Chemiebibliotheken. Als Machbarkeitsnachweis erstellte das Team eine Modellbibliothek mit 480 Mitgliedern, die Streptavidin (SA) als Zielstruktur haben, und identifizierte erfolgreich einen neuen SA-Liganden (MP29, Kᴅ ≈ 7,0 µM) mittels Bead-basiertem Screening. Dies unterstreicht den praktischen Nutzen der Plattform für die Entdeckung von Inhibitoren von Protein-Protein-Interaktionen.

2.4 Erreichen der Peptid-"Vernetzung" und Feinabstimmung der Helizität:

Diese Methode lässt sich flexibel zur Peptidverknüpfung anwenden. Am Beispiel eines bekannten zellundurchlässigen HIV-Kapsidprotein-Ligandenpeptids führte die Verknüpfung mittels IP⁺-Chemie an verschiedenen Positionen (i, i+4 oder i, i+7) erfolgreich zu Derivaten mit deutlich erhöhtem Helikalanteil. Interessanterweise ermöglicht die Verwendung verschiedener 2-Formylpyridin-Derivate für die Verknüpfung eine Feinabstimmung der Helizität des resultierenden verknüpften Peptids und eröffnet damit eine neue Dimension zur Optimierung von Peptidkonformation und -aktivität.

03 Ergebnisse und Diskussion

Durch systematische Synthese, Charakterisierung, Screening und Permeabilitätsprüfung wurden in der Studie die Machbarkeit, Allgemeingültigkeit und die einzigartigen Vorteile der IP⁺-Cyclisierungsstrategie umfassend validiert.

3.1 Substratspektrum der IP⁺-Makrocyclisierungsreaktion und optimale Ringgröße

Die Studie verifizierte zunächst die Durchführbarkeit der Reaktion anhand des Modellpeptids MP1 und erzielte dabei nahezu quantitative Ausbeuten und hohe Reinheiten. Anschließend wurde systematisch die Anwendbarkeit der Pyridinkomponente untersucht: 2-Formylpyridine mit elektronenspendenden Gruppen (Methyl, Methoxy, Piperidinyl usw.) oder kondensierten Ringen (Chinolin) erwiesen sich als hervorragende Substrate und lieferten makrocyclische Peptide in Ausbeuten von über 85 %. Auch 2-Ketopyridin reagierte problemlos und erweiterte so die Diversität. Untersuchungen der Ringgröße zeigten, dass diese Methode optimal für die Bildung von Makrocyclen mit 15–24 Atomen (aus Standardaminosäuren) geeignet ist. Durch die Einführung flexibler Linker (z. B. Ahx, Ipa) konnten auch makrocyclische Peptide mit Ringatomzahlen von bis zu 37–39 (MP18, MP19) effizient synthetisiert werden.

3.2 Breite Aminosäurekompatibilität und stabile Bindungschemie

Die Cyclisierungsreaktion ist mit den Seitenkettenschutzgruppen aller proteinogenen Aminosäuren, einschließlich Tyr, Trp, Arg, Lys, Cys, His, Glu usw., kompatibel. Die Reaktion verläuft in saurem Puffer (pH 4–5), wodurch basenempfindliche Nebenreaktionen vermieden werden. Die gebildete IP⁺-Bindung zeigte Stabilität unter physiologischen Bedingungen (37 °C, 24 Stunden) gegenüber verschiedenen Nukleophilen (Glutathion, 2-Mercaptoethanol, Hydrazin, Piperidin) sowie Oxidations- und Reduktionsmitteln und in einem breiten pH-Bereich (1–11), wodurch die Anforderungen für nachfolgende biologische Anwendungen erfüllt werden.

3.3 Effizienter Bibliotheksbau und funktionale Prüfung

Um die Eignung der Methode zum Aufbau von Substanzbibliotheken zu demonstrieren, synthetisierte das Team parallel 100 verschiedene IP⁺-makrozyklische Peptide in einer Mikrotiterplatte. Dazu wurden 20 verschiedene lineare Vorstufen mit 5 verschiedenen Pyridinaldehyden kombiniert. Die überwiegende Mehrheit der Produkte wies eine hohe Reinheit auf, was die Robustheit und Skalierbarkeit der Methode belegt. Darüber hinaus erstellte das Team eine fokussierte Bibliothek mit 480 Mitgliedern, die auf Streptavidin (SA) abzielen. Durch den Nachweis der Bindung von fluoreszenzmarkiertem SA an Beads gelang es ihnen, den hochaffinen Liganden MP29 zu identifizieren und seine mikromolare Bindungsaffinität (Kᴅ ≈ 7,0 µM) mittels kompetitiver Lösungsassays zu bestätigen. Dies unterstreicht das Potenzial dieser Methode zur Entdeckung funktioneller Liganden.

3.4 Vorläufige Untersuchung des außergewöhnlichen passiven Membranpermeabilitätsmechanismus und Validierung der zellulären Aufnahme

PAMPA-Tests zeigten die außergewöhnliche Membranpermeabilität von IP⁺-makrozyklischen Peptiden. Viele Verbindungen überschritten die Ro5-Grenzwerte deutlich und wiesen eine exzellente Permeabilität auf. Direkte Vergleichsexperimente ergaben, dass der Austausch der IP⁺-Brücke in MP36 durch eine neutrale Amid- oder Thioetherbrücke die Permeabilität um das 10- bis 100-Fache reduzierte, was die zentrale Bedeutung der IP⁺-Einheit bestätigte. Verschiedene Pyridinaldehyd-Derivate beeinflussten die Permeabilität signifikant, was darauf hindeutet, dass diese durch Strukturmodifikationen weiter optimiert werden kann. Vorläufige zelluläre Experimente (Chloralkan-Penetrationstest, CAPA) zeigten, dass IP⁺-makrozyklische Peptide mit einem zellpenetrierenden Tag effektiv in lebende Zellen eindringen können, die HaloTag exprimieren. Obwohl ihre Penetrationseffizienz geringer war als die einer niedermolekularen Kontrollsubstanz, ist dieses Ergebnis angesichts ihres deutlich höheren Molekulargewichts sehr vielversprechend.

04 Schlussfolgerung und Zukunftsperspektiven

Diese Studie entwickelte erfolgreich eine neuartige, effiziente und modulare Methode zur Synthese makrozyklischer Peptide basierend auf der Imidazopyridinium(IP⁺)-Bildung. Neben den milden Reaktionsbedingungen, den hohen Ausbeuten und dem breiten Substratspektrum liegt der größte Vorteil dieser Methode in der signifikanten Steigerung der passiven Membranpermeabilität durch die Einführung der IP⁺-Einheit. Dies ermöglicht es vielen makrozyklischen Peptiden, die die „Fünferregel“ verletzen, eine Transmembranfähigkeit zu erlangen, die der von arzneimittelähnlichen kleinen Molekülen ähnelt. In Kombination mit ihrer Eignung für die Erstellung und das Screening von Hochdurchsatz-Bibliotheken bietet diese Methode eine vielversprechende Plattform für die Entdeckung makrozyklischer Peptidwirkstoffe, die auf intrazelluläre, bisher schwer zugängliche Zielstrukturen abzielen.

Zusammenfassend liegt der zentrale Durchbruch dieser Arbeit in der direkten Integration eines „funktionellen Moduls“ mit einzigartigen physikochemischen Eigenschaften (permanente positive Ladung + hydrophobe Aromatizität) in das makrozyklische Peptidgerüst durch eine effiziente Zyklisierungsreaktion, wodurch eine exzellente Membranpermeabilität „kodiert“ wird. Dies unterscheidet sich von traditionellen Methoden, die Eigenschaften indirekt durch Feinabstimmung der Peptidsequenz und -konformation verbessern, und bietet einen direkteren und allgemeineren Ansatz. Zukünftige Forschung könnte sich auf Folgendes konzentrieren: ① Detaillierte Untersuchung der quantitativen Struktur-Wirkungs-Beziehung zwischen der IP⁺-Einheitsstruktur und der Membranpermeabilität, um Varianten mit noch besserer Permeabilität rational zu entwickeln; ② Integration der IP⁺-Chemie in Ultra-Hochdurchsatz-Screening-Plattformen wie mRNA-Display oder DNA-kodierte Bibliotheken, um Leitstrukturen für intrazelluläre Zielstrukturen im großen Maßstab zu identifizieren; ③ Validierung der in vivoAktivität und Eignung von IP⁺-makrozyklischen Peptiden als Arzneimittelwirkstoffe in komplexeren Krankheitsmodellen.

Li, Bo, et al. „Synthese von membrangängigen makrozyklischen Peptiden durch Imidazopyridinium-Pfropfung.“Zeitschrift der Amerikanischen Chemischen Gesellschaft146.21 (2024): 14633-14644.