Hydrophobe Markierung unterstützte Flüssigphasensynthese von Tirzepatid

Heute präsentieren wir einen wichtigen Forschungsartikel des Teams um Lin Dong, erschienen in Organic Letters. Die Arbeit befasst sich mit den Herausforderungen der kostenintensiven und aufwendigen Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) für das Peptidmedikament Tirzepatid (ein neuartiger Dual-Target-Agonist zur Behandlung von Typ-2-Diabetes und Adipositas). Dazu wurde eine neuartige Strategie der hydrophoben Tag-gestützten Flüssigphasen-Peptidsynthese (LPPS) entwickelt. Diese Methode nutzt lösliche hydrophobe Tags (TAGa und TAGb) und deren einzigartige Löslichkeitseigenschaften für eine effiziente Trennung, wodurch Aminosäure- und Lösungsmittelverluste deutlich reduziert werden. Zudem wird eine Doppelschutzstrategie (Cbz/Fmoc) an Lysin eingesetzt, um die Seitenkettenbildung präzise zu steuern und so das 39 Aminosäuren umfassende Tirzepatid mit hoher Ausbeute zu synthetisieren. Diese Arbeit bietet einen neuen Ansatz für die umweltfreundliche und wirtschaftliche Herstellung komplexer Peptidmedikamente im großen Maßstab.

Abbildung 1. Struktur von Tirzepatid.

01 Forschungshintergrund

Als erster dualer GIP/GLP-1-Rezeptoragonist hat Tirzepatid eine herausragende Wirksamkeit in der Behandlung von Diabetes und Adipositas gezeigt. Seine Synthese basiert jedoch größtenteils auf der traditionellen Festphasen-Peptidsynthese (SPPS). Obwohl SPPS eine ausgereifte Technologie ist, weist sie inhärente Nachteile auf, wie hohe Harzkosten, abnehmende Kopplungseffizienz mit zunehmender Peptidkettenlänge und komplexe Reinigungsschritte, insbesondere bei langen Peptiden wie Tirzepatid (39 Aminosäuren), bei denen die Gesamtausbeute oft unter 10 % liegt. Die Flüssigphasen-Peptidsynthese (LPPS) kann auf Harz verzichten, steht aber vor Herausforderungen wie der schwierigen Kontrolle der Produktlöslichkeit und der aufwendigen Isolierung von Zwischenprodukten. Obwohl in den letzten Jahren hybride SPPS/LPPS-Strategien beschrieben wurden, bleiben die Produktionskosten hoch. Die hydrophobe Tag-assistierte LPPS führt lösliche Tags ein, die die Peptidkette im Reaktionssystem löslich halten und so eine einfache Fällung zur Trennung ermöglichen. Dadurch werden die Vorteile der homogenen Reaktion der Flüssigphasensynthese mit der Trenneffizienz der Festphasensynthese kombiniert. Diese Studie ist die erste, die diese Strategie auf die Totalsynthese von Tirzepatid anwendet, mit dem Ziel, einen effizienten, wirtschaftlichen und skalierbaren Syntheseweg zu etablieren.

02 Innovative Highlights

Hydrophobe Tags mit Doppelfunktion ermöglichen flexible Steuerung der C-terminalen Säure-/Amidsynthese: Das Forschungsteam entwickelte und synthetisierte zwei strukturell anpassbare hydrophobe Tags, TAGa (Alkoxybenzylalkohol-Typ) und TAGb (Rinker-Linker-Typ), die sich für die Synthese von C-terminalen Carbonsäuren bzw. C-terminalen Amiden eignen. TAGa ermöglicht die Produktgewinnung durch einfache Acetonitril-Fällung, während TAGb direkt an das C-terminale Serinamid von Tirzepatid binden kann, wodurch zusätzliche Aktivierungsschritte entfallen. Die hydrophobe Natur der Tags (basierend auf einer Docosylkette) gewährleistet gute Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln und quantitative Fällung in unpolaren Lösungsmitteln und ermöglicht so einen Zyklus aus homogener Reaktion und heterogener Trennung.

Segmentale Assemblierung und Lysin-Doppelschutzstrategie überwinden Herausforderungen bei der Seitenkettenmodifizierung: Die 39-mer-Peptidkette wurde gezielt in vier vollständig geschützte Zwischenprodukte (jeweils 7–14 Aminosäuren) unterteilt, wodurch die Komplexität der Einzelreaktion durch iterative Kupplung reduziert wurde. Für den kritischen Schritt der Lys20-Seitenkettenmodifizierung wurde eine innovative Doppelschutzstrategie mit Cbz/Fmoc-Gruppen eingesetzt: Fmoc diente der temporären Entschützung zur Anbindung des Seitenkettenfragments, während Cbz im letzten Schritt entfernt wurde, um die Kupplung mit der Hauptkette zu ermöglichen. Dieses orthogonale Schutzdesign vermied Probleme wie hohe Kosten und zahlreiche Nebenreaktionen, die mit der traditionellen Alloc-Schutzgruppe verbunden sind, und verbesserte die Präzision der Seitenkettenassemblierung signifikant.

Eintopf-Entschützung und -Fällung ermöglichen die direkte Gewinnung von hochreinem Endprodukt: Am Ende der Synthese wurde das vollständig geschützte Peptid-Tag-Konjugat direkt mit einer TFA-Mischung, die 2,5 % TIS und 2,5 % H₂O enthielt, behandelt. Dadurch wurden die Seitenketten-Entschützung und die Abspaltung des Tags in einem Schritt erreicht und die Fällung des Rohpeptids gefördert. Dieses Eintopfverfahren vermied aufwendige chromatographische Reinigungsschritte. Das Rohprodukt lieferte nach einfacher Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) Tirzepatid mit einer Reinheit von über 90 %, wodurch die Syntheseeffizienz deutlich gesteigert wurde.

03 Ergebnisse und Diskussion

3.1 Synthese und Validierung der Eigenschaften hydrophober Tags

In der Studie wurden zunächst die beiden hydrophoben Kern-Tags TAGa und TAGb synthetisiert. TAGa wurde ausgehend von Benzaldehyd durch reduktive Alkylierung mit einer Docosylkette hergestellt, wodurch eine Alkoxybenzylalkohol-Struktur entstand. TAGb wurde durch Kondensation von Benzaldehyd mit 2,4-Dimethoxybenzylamin gebildet, wodurch ein Amin-Tag mit einem Rinker-Linker entstand. Die Charakterisierung wichtiger physikochemischer Eigenschaften zeigte, dass sowohl TAGa als auch TAGb in polaren Lösungsmitteln wie DMF und THF eine Löslichkeit von über 50 mg/ml aufweisen, jedoch durch Zugabe des Vierfachen ihres Volumens an Acetonitril quantitativ ausgefällt werden (Ausbeute > 95 %). Dieses signifikante Löslichkeitsänderungsverhalten bildet die Grundlage für den nachfolgenden Zyklus aus homogener Reaktion und heterogener Trennung.

Schema 1. Synthese von TAGa und TAGb

3.2 Segmentale Peptidsynthese und taggesteuerte Kopplungsoptimierung

Die vollständige Tirzepatid-Sequenz wurde in vier Fragmente (Zwischenprodukte I–IV) unterteilt, wobei Zwischenprodukt II die Modifikationsstelle der Lys20-Seitenkette enthielt. Am Beispiel der TAGa-vermittelten Synthese von Zwischenprodukt I (Schema 2) wurde zunächst Fmoc-Gly-OH mittels DIC/DMAP-Katalyse an TAGa gekoppelt. Nach Acetonitril-Fällung wurde TAGa-Gly-OH mit einer Ausbeute von 92 % erhalten. Anschließend wurde die Fmoc-Schutzgruppe mit 1 % DBU/Piperidin abgespalten, um die Aminogruppe freizulegen. Diese wurde dann mit der nächsten Fmoc-geschützten Aminosäure mittels des HBTU/HOBt/DIPEA-Systems gekoppelt. Dieser Zyklus wurde wiederholt, wodurch Zwischenprodukt I mit sieben Aminosäuren erfolgreich synthetisiert wurde. Die Kopplungseffizienz lag jeweils über 98 % (HPLC-überwacht), und die Reinheit des Rohprodukts betrug über 85 %.

Abbildung 2. Strategien zur Totalsynthese von Tirzepatid.

Zwischenprodukt IV mit seinem C-terminalen Amid stellte eine synthetische Herausforderung dar. Das Forschungsteam versuchte zunächst, TAG-COOH zu synthetisieren und es anschließend mit dem C-terminalen Serinamid zu koppeln, scheiterte jedoch aufgrund sterischer Hinderung und mangelnder Selektivität der Reaktionsstelle. Der schließlich erfolgreiche Ansatz bestand darin, TAGb direkt mit dem Serinamid über die exponierte Aminogruppe zu verknüpfen, wodurch TAGb-Zwischenprodukt IV mit einer Ausbeute von 88 % für diesen Schritt erhalten wurde (Schema 2).

Schema 2. Synthese von TAGa-Zwischenprodukten und Zwischenprodukt IV

3.3 Präzise Seitenkettenassemblierung: Erfolgreiche Implementierung der Dual-Protection-Strategie

Das Zwischenprodukt II mit der Lys20-Seitenkettenmodifikation war für die Synthese von zentraler Bedeutung. Zunächst wurde die Lys-Seitenkette mit der Alloc-Gruppe geschützt, doch die Abspaltung der Schutzgruppe führte zu Nebenreaktionen, die sich in auslaufenden Flecken und einer Produktverdunkelung im Dünnschichtchromatographie-Bild äußerten. Daher entwickelte das Team eine innovative Doppelschutzstrategie mit Cbz und Fmoc (Schema 3). Zunächst wurden Cbz und Fmoc gleichzeitig an das Lys des Subfragments II-a eingeführt. Im ersten Schritt wurde Fmoc selektiv mit DBU/Piperidin abgespalten, und die freigelegte Aminogruppe wurde zur Verknüpfung mit dem Seitenkettenfragment II-b genutzt. Im zweiten Schritt wurde Cbz mittels Pd/C-katalysierter Hydrogenolyse entfernt, wodurch eine weitere Aminogruppe für die Kupplung mit dem Hauptkettenfragment II-c freigelegt wurde. Mit dieser Strategie konnte die Seitenkette präzise eingeführt werden, was schließlich zu TAGa-Zwischenprodukt II mit einer Gesamtausbeute von bis zu 78 % führte. Das Team versuchte, das Zwischenprodukt II-a' durch Umlagerung der Schutzgruppe zu erhalten, hatte jedoch keinen Erfolg, wahrscheinlich aufgrund der geringen Entschützungsreaktivität von Cbz an dieser Stelle.

Schema 3. Synthese des Zwischenprodukts II

3.4 Charakterisierung der kompletten Baugruppe und des Endprodukts

Die vier Fragmente wurden sequenziell mittels Tag-vermittelter Kupplung verknüpft: Wie in Schema 4 dargestellt, wurden die vier Zwischenprodukte durch iterative Kupplung zum vollständigen Molekül zusammengefügt. Zunächst wurde nach Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe von TAGb-Zwischenprodukt IV dieses mit dem de-tagierten TAGa-Zwischenprodukt III gekuppelt, wodurch TAGb-Zwischenprodukt VI entstand. Analog wurden TAGa-Zwischenprodukt I und II gekuppelt, um TAGa-Zwischenprodukt V zu erhalten. Schließlich wurden die beiden großen Fragmente zum vollständig geschützten Zielpeptid-TAG-Konjugat verknüpft. Nach Abspaltung der Schutzgruppe mit dem TFA/TIS/H₂O-Gemisch fiel das Rohprodukt mit einer Ausbeute von 78 % aus. Nach RP-HPLC-Reinigung wurde hochreines Tirzepatid als weißes Pulver erhalten, was den Erfolg der Synthese bestätigte.

Schema 4. Synthese von Tirzepatid

04 Schlussfolgerung und Zukunftsperspektiven

In dieser Studie wurde erfolgreich eine hydrophobe Tag-gestützte Flüssigphasensynthesestrategie entwickelt, die die effiziente Herstellung von Tirzepatid ermöglicht. Die Vorteile dieser Methode sind: ① Die Tag-gesteuerte Fällungsreinigung vermeidet den Einsatz von Harzen und häufige chromatographische Trennungen und reduziert den Lösungsmittelverbrauch um ca. 40 %. ② Die Doppelschutzstrategie gewährleistet die präzise Einführung von Seitenketten und erhöht die Gesamtausbeute im Vergleich zur traditionellen Festphasenpeptidsynthese um das 2,3-Fache. ③ Die Eintopf-Entschützung und Fällung vereinfacht die letzten Arbeitsschritte. Zukünftig bietet diese Methode vielversprechende Möglichkeiten für die Synthese weiterer modifizierter Peptide (wie Glykopeptide und fluoreszenzmarkierte Peptide). Die Optimierung der Tag-Struktur (z. B. durch Einführung photolabiler Gruppen) könnte eine räumlich und zeitlich kontrollierte Freisetzung ermöglichen. In Kombination mit Durchflussreaktoren hat sie das Potenzial, eine kontinuierliche Produktion von Tirzepatid im Kilogramm-Maßstab zu realisieren und damit ein neues Paradigma für die umweltfreundliche Herstellung von Peptidwirkstoffen zu schaffen.

Originalartikel

Pang ZJ, Mao CY, Feng TT, Dong L. Hydrophob-Tag-unterstützte Flüssigphasensynthese von Tirzepatid. Org Lett. 2025 Sep 19;27(37):10442-10446.

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.orglett.5c03314