Gängige Syntheseverfahren und Optimierungsforschung von Polypeptid-Wirkstoffen (APIs)

Die Syntheseverfahren für Polypeptid-Wirkstoffe (APIs) lassen sich im Wesentlichen in drei Kategorien unterteilen: Festphasen-Peptidsynthese (SPPS), Flüssigphasen-Peptidsynthese (LPPS) und Fragmentkondensation. SPPS hat sich aufgrund seiner einfachen Handhabung, des hohen Automatisierungsgrades und der Eignung für die Massenproduktion als Standardverfahren etabliert und macht über 85 % der weltweiten Polypeptid-API-Produktion aus. LPPS wird hauptsächlich zur Synthese kurzer Peptide (≤ 10 Aminosäuren) und speziell strukturierter Peptide eingesetzt. Die Fragmentkondensation eignet sich für die Synthese langkettiger Peptide (≥ 30 Aminosäuren) und komplexer cyclischer Peptide und kann kumulative Fehler und die Bildung von Verunreinigungen bei der Synthese langkettiger Peptide effektiv reduzieren.

1. Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) und ihre Optimierung

Die Festphasenpeptidsynthese (SPPS) nutzt ein Festphasenharz als Träger, um Peptidketten schrittweise durch eine zyklische Reaktion aus „Entschützung, Aktivierung und Kupplung“ aufzubauen. Ihre Hauptvorteile liegen im homogenen Reaktionssystem, der einfachen Produktabtrennung und der Möglichkeit zur automatisierten, kontinuierlichen Produktion, wodurch die Anforderungen der GMP-konformen Großproduktion erfüllt werden. Die Kernschritte des Prozesses umfassen die Harzauswahl, die Auswahl der geschützten Aminosäuren, die Optimierung des Kondensationssystems sowie die Optimierung der Abspaltungs- und Reinigungsprozesse. Jeder dieser Schritte beeinflusst direkt die Produktausbeute und -reinheit.

1.1 Optimierung der Verbindungen im Kernprozess

Die Harzauswahl sollte in Abhängigkeit von der Peptidkettenlänge und der Aminosäurezusammensetzung erfolgen. Gängige Harze sind Wang-Harz (geeignet für C-terminale Carboxylpeptide), Rink-Amid-Harz (geeignet für C-terminale Amidpeptide) und 2-CTC-Harz (geeignet für Fragmentkondensation). Um Peptidkettenbrüche durch Harzabbau zu vermeiden, ist es wichtig, auf den molaren Substitutionskoeffizienten, den Quellkoeffizienten und die Stabilität des Harzes zu achten. Als Ausgangsmaterialien beeinflusst die Qualität der geschützten Aminosäuren direkt die Qualität des finalen Polypeptidprodukts. Verunreinigungen wie chirale Isomere, unvollständig geschützte Aminosäuren und Dipeptidderivate müssen streng kontrolliert werden. Hochreine (≥ 99 %) Fmoc/Boc-geschützte Aminosäuren sind zu bevorzugen. Racemisierungsanfällige Aminosäuren wie Histidin und Cystein sollten mit sterisch anspruchsvollen Seitenkettenschutzgruppen (z. B. Propylenglykol und Styrol) kombiniert werden, um die Bildung von Racemisierungsverunreinigungen zu verhindern.

Das Kondensationssystem ist der Kern der SPPS-Prozessoptimierung. Daher ist die Auswahl effizienter Kondensationsreagenzien und Additive mit geringer Racemisierung unerlässlich. Derzeit werden in der Industrie hauptsächlich Harnstoffsalz-Kondensationsreagenzien der zweiten Generation (HATU, HBTU) in Kombination mit HOAt/OxymaPure-Additiven eingesetzt, wodurch die Racemisierungsrate unter 0,1 % gehalten werden kann. Der Einsatz von Ynamid-Kondensationsreagenzien der dritten Generation (Zhao-Reagenz) ermöglicht eine racemisierungsfreie Synthese (Racemisierungsrate

Für die Abspaltung müssen geeignete Abspaltungsreagenzien entsprechend der Art der Schutzgruppe ausgewählt werden. Beim Fmoc-Schutzsystem wird üblicherweise eine TFA-Abspaltungslösung (mit Fängern wie Triisopropylsilan und Ethandithiol) verwendet, die Seitenkettenschutzgruppen effektiv entfernt und die Oxidation der Peptidkette reduziert. Beim Boc-Schutzsystem wird eine TFA/Trifluormethansulfonsäure-Abspaltung durchgeführt, wobei Temperatur und Zeit der Abspaltung streng kontrolliert werden müssen, um die Oxidation von Aminosäuren wie Tryptophan und Methionin zu vermeiden. Die Reinigung erfolgt hauptsächlich mittels präparativer HPLC. Die Zusammensetzung der mobilen Phase (z. B. Acetonitril-Wasser-TFA-System), der Elutionsgradient und die Probenmenge müssen optimiert werden, um eine Reinheit des Zielpeptids von ≥ 98 % zu gewährleisten und die Bildung polymerer Verunreinigungen während der Reinigung zu minimieren.

1.2 Grenzen der Prozessoptimierung

In den letzten Jahren wurde das SPPS-Verfahren im Hinblick auf „Umweltfreundlichkeit, Automatisierung und Kontinuität“ weiterentwickelt. Die Anwendung der mechanochemischen (Kugelmühlen-)Synthesetechnologie ohne Lösungsmittel reduziert den Verbrauch organischer Lösungsmittel um mehr als 40 % und hemmt gleichzeitig die Racemisierung. Dies ist ideal für die großtechnische Herstellung von Blockbuster-Produkten wie Semaglutid und Liraglutid. Die Modernisierung automatisierter Peptidsynthesizer ermöglicht die „Ein-Klick“-Entschützung, -Kupplung und -Überwachung. In Kombination mit der Online-UV-AU-Überwachungstechnologie können die Endpunkte der Kupplung und Entschützung in Echtzeit überwacht und menschliche Fehler minimiert werden. Die Anwendung der kontinuierlichen Durchfluss-Mikroreaktionstechnologie ermöglicht die präzise Steuerung von Reaktionstemperatur, -zeit und Reagenzienkonzentration, erhöht die Kupplungseffizienz in einem Schritt auf über 99 % und reduziert die Anreicherung von Verunreinigungen signifikant.

2. Flüssigphasen-Peptidsynthese (LPPS) und ihre Optimierung

Die LPPS nutzt eine Lösungsphasenreaktion zur schrittweisen Synthese von Peptidketten. Sie eignet sich für die Synthese kurzer Peptide (wie Pentapeptide und Hexapeptide) sowie hydrophober, aggregationsanfälliger Peptide. Ihre Hauptvorteile liegen in der hohen Selektivität der Reaktion, der einfachen Kontrolle der Produktreinheit und dem Verzicht auf Harztrennungsschritte. Die Prozessoptimierung konzentriert sich auf die Auswahl des Lösungsmittels, die Kontrolle der Reaktionsbedingungen sowie die Produktabtrennung und -reinigung.

Als Lösungsmittel sollte ein System mit moderater Polarität und guter Löslichkeit für Aminosäuren (z. B. DMF, DCM, NMP) verwendet werden. Stark polare Lösungsmittel sind zu vermeiden, um die Aggregation der Peptidketten zu verhindern. Die Reaktionstemperatur wird auf 0–5 °C (für racemisierungsanfällige Aminosäuren) bzw. 25 °C (für konventionelle Aminosäuren) eingestellt, um Racemisierung und Peptidkettenabbau zu minimieren. Für die Kupplungsreaktion empfiehlt sich eine Präaktivierungsstrategie, bei der die geschützte Aminosäure vor Zugabe zum Reaktionssystem mit dem Kondensationsreagenz präaktiviert wird, um die Kupplungseffizienz zu verbessern. Zur Trennung und Reinigung eignen sich Methoden wie Extraktion, Umkristallisation und Säulenchromatographie, die für die Forschung und Entwicklung im kleinen Maßstab sowie die Herstellung kundenspezifischer Polypeptid-Wirkstoffe geeignet sind. In der großtechnischen Produktion ist eine Kombination mit dem Festphasenpeptidsynthese-Verfahren (SPPS) erforderlich, um die jeweiligen Vorteile zu nutzen.

3. Fragmentkondensationsprozess und seine Optimierung

Bei langkettigen Peptiden (≥ 30 Aminosäuren) und komplexen cyclischen Peptiden ist das Einzel-SPPS-Verfahren anfällig für Probleme wie Peptidkettenaggregation, verringerte Kopplungseffizienz und Anreicherung von Verunreinigungen. Das Fragmentkondensationsverfahren hat sich daher als optimale Alternative erwiesen. Dessen Kernidee besteht darin, die lange Peptidkette in 2–4 kurze Peptidfragmente zu spalten, die jeweils mittels SPPS/LPPS synthetisiert und gereinigt und anschließend durch eine Kondensationsreaktion zu einer vollständigen Peptidkette verknüpft werden. Dies reduziert effektiv den Druck der Einzelreaktion und verbessert die Reinheit des Endprodukts.

Der Fokus der Prozessoptimierung liegt auf der Auswahl der Fragmentspaltungsstellen und der Kontrolle der Kondensationsbedingungen: Racemisierungsanfällige Aminosäuren (His, Cys) und Bereiche mit hoher Dichte hydrophober Aminosäuren sollten bei der Fragmentspaltung vermieden werden; stabile Aminosäuren wie Gly und Ala sind als Spaltungsstellen vorzuziehen. Für die Kondensationsreaktion sollten effiziente Kondensationsreagenzien (wie PyBOP, COMU) verwendet werden. Die Reaktionskonzentration und der pH-Wert müssen kontrolliert werden, um eine Selbstpolymerisation der Fragmente zu verhindern. Die Reinheit der Fragmente sollte über 99 % liegen, um Verunreinigungen im Endprodukt zu minimieren. In den letzten Jahren hat die Anwendung orthogonaler Schutzgruppenstrategien (wie dem DNPBS/Fmoc-Doppelschutzsystem) die präzise Abspaltung und Verknüpfung von Fragmenten ermöglicht und so die Effizienz und Reinheit der Fragmentkondensation weiter verbessert.

4. Prozessvalidierung und Anforderungen an die Einhaltung der Vorschriften

Die Prozessvalidierung von Polypeptid-APIs muss den GMP-Anforderungen entsprechen und die Prozessleistungsqualifizierung (PPQ), Reinigungsvalidierung, Materialvalidierung und weitere relevante Aspekte umfassen. Es ist notwendig, die wichtigsten Prozessparameter (wie Kopplungszeit, Temperatur, Reagenziendosierung und Reinigungsgradient) zu klären und die Prozessstabilität durch mindestens drei aufeinanderfolgende Produktionschargen zu gewährleisten. Bei der Reinigungsvalidierung müssen angemessene Rückstandsgrenzwerte für Restpeptide, Reagenzien und Lösungsmittel festgelegt und Methoden wie HPLC-MS zur Detektion eingesetzt werden, um Kreuzkontaminationen auszuschließen. Die Materialvalidierung sollte alle Ausgangsmaterialien wie geschützte Aminosäuren, Harze und Lösungsmittel umfassen und einen vollständigen Materialqualitätsstandard gemäß ICH Q11 etablieren. Harze werden als Ausgangsmaterialien nicht empfohlen; detaillierte Berichte zur Herkunft und Qualitätsprüfung sind vorzulegen.