Neue hypervalente Iod-Aminosäure-Bausteine ​​ermöglichen die Makrozyklisierung von Peptiden

Heute stellen wir Ihnen eine wichtige Studie vor, die in veröffentlicht wurde. Angewandte Chemie International EditionDas Forschungsteam um Professor Jérôme Waser an der École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) in der Schweiz hat die Herausforderung der ortsspezifischen Einführung einer einzelnen, stabilen reaktiven Gruppe in ein Peptid zur Steuerung der nachfolgenden Makrozyklisierung erfolgreich gelöst. Die Studie entwickelte unnatürliche Aminosäure-Bausteine ​​(NPAA) mit einem Ethinylbenziodoxol-(EBx)-Kern. Diese Bausteine ​​(z. B. Fmoc-Lys(EBx)-OH) sind vollständig kompatibel mit der Standard-Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) und der Lösungsphasen-Peptidsynthese (SPS). Sie ermöglichen die präzise und spezifische Einführung der hochreaktiven EBx-Gruppe an jeder beliebigen Position innerhalb einer komplexen Peptidkette mit mehreren identischen Resten (z. B. mehreren Lysinen). Darauf aufbauend erzielten die Forscher verschiedene effiziente und milde Peptidmakrozyklisierungsreaktionen und synthetisierten erfolgreich strukturell einzigartige und topologisch vielfältige monocyclische und bicyclische Peptide. Dies erweitert das Repertoire an Werkzeugen für Chemiker zur Erstellung cyclischer Peptidbibliotheken erheblich.

01 Forschungshintergrund

Die Makrozyklisierung von Peptiden ist eine Schlüsselstrategie zur Verbesserung der metabolischen Stabilität, der Bindungsaffinität und der biologischen Aktivität. Die orts- und chemoselektive Zyklisierung einer ungeschützten Peptidkette mit mehreren identischen reaktiven Resten (z. B. Lysin, Cystein) stellt jedoch eine große Herausforderung dar. Ein gängiger Ansatz besteht darin, zwei nicht-natürliche Aminosäuren mit komplementären reaktiven Gruppen (z. B. Alkin-Azid, Alken-Alken) für die Zyklisierung mittels Click-Chemie einzuführen. Dies schränkt jedoch die verfügbaren Aminosäurekombinationen und die strukturelle Vielfalt ein. Eine andere Strategie ist die Einführung einer einzelnen reaktiven Gruppe, die mit einem nativen Rest innerhalb der Peptidkette reagiert. Bestehende Methoden (z. B. mit Acrylaten oder Arylhalogeniden) erfordern jedoch häufig aggressive Bedingungen (starke Basen, hohe Temperaturen) oder die Verwendung geschützter Peptide, was ihre Anwendbarkeit einschränkt. Daher besteht im Bereich der Wirkstoffforschung mit cyclischen Peptiden ein dringender Bedarf an neuen Methoden, die unter milden und anwenderfreundlichen Bedingungen präzise eine einzelne, hocheffiziente und bioorthogonale reaktive Gruppe an beliebiger Position einer Peptidkette einführen können. Hypervalente Iodreagenzien mit ihrer geringen Toxizität, hohen Reaktivität und Selektivität bieten Potenzial für die Peptidmodifizierung. Unter ihnen wurden Ethinylbenziodoxolon (EBX)-Reagenzien bereits für die Peptidalkinylierung eingesetzt. Frühere Versuche, sie als Bausteine ​​in Peptidketten zu integrieren, scheiterten jedoch an ihrer Instabilität unter den aggressiven Säure-Base-Bedingungen der Festphasenpeptidsynthese (SPPS).

02 Innovative Highlights

Erfolgreiche Umwandlung von instabilem EBX in stabile EBx-Aminosäurebausteine

Das Forschungsteam verzichtete auf den klassischen EBX-Kern mit einer Carbonylgruppe und verwendete stattdessen einen stabileren trifluormethylierten Ethinylbenziodoxol-Kern (EBx). Durch selektive Amidierung seines aktiven Esters mit dem freien Amin von kommerziell erhältlichem, Fmoc-geschütztem Lysin, Ornithin oder 2,4-Diaminobuttersäure synthetisierten sie erfolgreich nicht-natürliche Aminosäurebausteine ​​im Grammmaßstab, wie z. B. Fmoc-Lys/Orn/Dap(EBx)-OH. Der Schlüssel zu diesem Design liegt darin, dass der EBx-Kern die für die nachfolgende Peptidsynthese und Cyclisierung notwendige hohe Reaktivität beibehält und gleichzeitig die erforderliche Stabilität aufweist.

Erste Demonstration der Toleranz von EBx Core gegenüber dem kompletten SPPS/SPS-Workflow

Dies ist einer der zentralen Durchbrüche dieser Studie. Die Forschung bestätigt, dass die entwickelten EBx-Aminosäurebausteine ​​perfekt mit den mehrfachen Entschützungs- und Kupplungszyklen der Standard-Fmoc-Festphasenpeptidsynthese (Fmoc-SPPS) kompatibel sind. Selbst wenn der EBx-Baustein mitten in eine Peptidkette eingefügt wird und bis zu 10 Synthesezyklen (insgesamt 23 chemische Schritte) durchlaufen werden, kann das Zielpeptid-EBx in akzeptablen Ausbeuten (5–13 %) erhalten werden, verglichen mit einer Ausbeute von 25 % für das Kontrollpeptid ohne EBx. Gleichzeitig eignet sich dieser Baustein auch für die Peptidsynthese in Lösung und ist beständig gegenüber Bedingungen wie der Boc-Entschützung (TFA) und der Esterhydrolyse (LiOH).

Erzielung einer präzisen Funktionalisierung von Polyamin-Substraten

Durch die Nutzung der Ortsspezifität der Festphasenpeptidsynthese (SPPS) kann die EBx-Gruppe präzise an jedem beliebigen Lysin oder N-terminalen Amin der Peptidkette eingeführt werden. Selbst bei Vorhandensein mehrerer Lysine ist eine ortsspezifische Modifizierung an einer einzelnen Position möglich (z. B. Peptide). 4d, 4iDadurch werden die Probleme mit der mangelhaften Selektivität, die bei der Modifizierung von Polyamin-Substraten im späten Stadium mit bifunktionellen EBx-Reagenzien auftreten, überwunden und eine beispiellose Kontrollpräzision erreicht.

Bahnbrechende Strategien für die Zyklisierung und das Heften mehrerer Materialien basierend auf einem einzigen EBx-Griff

Die erhaltenen Peptid-EBx-Zwischenprodukte können den EBx-Kern als vielseitige reaktive Gruppe nutzen. Er reagiert unter milden Bedingungen mit verschiedenen nativen Resten innerhalb der Peptidkette (z. B. freie Aminogruppen, Cystein, Tryptophan, Indolring). Dies ermöglicht verschiedene Cyclisierungsmodi wie Lactamisierung, Cys-Lys-Verknüpfung und Alkinylierung/Cyclisierung der Tryptophan-CH-Bindung. Die Plattform ermöglicht die effiziente Synthese von monocyclischen, bicyclischen und verknüpften Peptiden mit unterschiedlichen Topologien, darunter ein 18-meres Peptid, und demonstriert damit ihr großes Potenzial für die Herstellung strukturell vielfältiger cyclischer Peptide.

03 Ergebnisse und Diskussion

3.1 Herstellung von EBx-Aminosäurebausteinen im Grammmaßstab

Verwendung des bifunktionellen EBx-Reagenz 2a(mit einem aktiven Ester) und kommerziellen Fmoc-Aminosäuren, Synthesen von Fmoc-Lys(EBx)-OH im Grammmaßstab (3a), Fmoc-Orn(EBx)-OH (3b), und Fmoc-Dap(EBx)-OH (3cDie Synthese der Produkte erfolgte erfolgreich mittels einfacher Amidierungsreaktionen. Die Produkte wurden mit einer HPLC-Reinheit von >77 % erhalten, ohne dass eine säulenchromatographische Reinigung erforderlich war; die Synthese erfolgte lediglich durch Extraktion und Gefriertrocknung, was die Praktikabilität im präparativen Maßstab belegt.

3.2 Validierung der breiten Kompatibilität bei der Festphasen-Peptidsynthese

Verwendung von Bausteinen 3ain SPPS, eine Reihe von Peptid-EBx-Derivaten (4a-4o) wurden erfolgreich synthetisiert. Die Ergebnisse belegten, dass der EBx-Kern verschiedene Aminosäureseitenketten (freie Säure, Amin, Amid, Histidin, Tryptophan, Tyrosin usw.) toleriert. Entscheidend ist, dass er eine selektive Modifizierung ermöglicht: Beispielsweise wurde in einem Hexapeptid mit zwei Lysinen nur das eine modifiziert (4d); außerdem ermöglichte es die selektive Modifizierung eines spezifischen Lysins im 11-mer Substanz-P-Peptid in Gegenwart eines freien N-Terminus (4 lSelbst wenn EBx am C-Terminus platziert wird, was 10 Synthesezyklen erfordert, ist das Produkt (4owurde erfolgreich gewonnen, was seine ausgezeichnete Stabilität beweist.

3.3 Anwendung in der Peptidsynthese in Lösung

Boc-Lys(EBx)-OMe (5) wurde erfolgreich synthetisiert. Unter Verwendung sowohl der C-zu-N-Strategie (Boc-Entschützung mit TFA, gefolgt von Kupplung) als auch der N-zu-C-Strategie (Esterhydrolyse mit LiOH, gefolgt von Kupplung) wurden Dipeptidprodukte (6a, 6b, 7a, 7bDie Produkte wurden in guten Ausbeuten (45–60 % über zwei Stufen) erhalten. Die SPS konnte im 100-µmol-Maßstab mit nur 1,05 Äquivalenten der Aminosäure EBx durchgeführt werden, was ihre Eignung für die Synthese im größeren Maßstab unterstreicht.

3.4 Multimodale Cyclisierungsreaktionen und Anwendungen

Laktamisierung:Ausgehend von linearen Peptiden 4t, das freie N- und C-Termini und ein Lys(EBx) enthält, wurde unter basischen Bedingungen intramolekular lactamisiert, wodurch ein cyclisches Peptid entstand. 8aEs wurde in 29% Ausbeute aus der Festphasenpeptidsynthese erhalten. Seine Struktur ähnelt dem Naturstoff Pseudostellarin G.

„Umgekehrte“ Cys-Lys-Heftung:Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden (bei denen ein EBx-Reagenz Cys modifiziert, welches dann Lys angreift), wurde in dieser Studie EBx vorab an einem bestimmten Lysinrest installiert. Hexapeptid 4uNach der Harzabspaltung und unter milden basischen Bedingungen erfolgte erfolgreich ein intramolekularer Angriff von Cys auf Lys(EBx), wodurch ein stabilisiertes cyclisches Peptid entstand. 8bNoch beeindruckender ist, dass in einem 18-Rest-α-helikalen Peptid die selektive Anbringung von EBx an das Lys an der i+5-Position eine spezifische Verknüpfung mit dem Cys an der i-Position ermöglichte (8c), wodurch die dieser Sequenz inhärente i/i+4-Heftpräferenz untergraben wird.

Lys-Lys-Formalverknüpfung und bicyclische Peptidsynthese:Durch die Verwendung von goldkatalysierter Tryptophan-C2-H-Bindungs-Alkinylierung wird die EBx-Gruppe im Peptid 4Vunterzog sich einer Cyclisierung mit dem freien Amin eines weiteren intramolekularen Lysins, wodurch 8dDes Weiteren, ausgehend von 4w, ein bicyclisches Peptid 8ewurde effizient in zwei Schritten (38% Ausbeute) durch eine anfängliche intramolekulare Trp C2-Alkinylierungscyclisierung, gefolgt von einer N-zu-C-Lactamisierung, hergestellt.

Aufbau einer diversen Bibliothek zyklischer Peptide:Ausgehend vom gleichen 11-Peptid-Grundgerüst werden durch Anbringen der EBx-Gruppe an verschiedenen Positionen (Trp, Lys, Orn, Dap) und anschließende goldkatalysierte Cyclisierung mit einem weiteren intramolekularen Lys- oder Trp-Rest cyclische Peptide hergestellt. 8f-8iEs wurden erfolgreich Peptide mit unterschiedlicher Konnektivität und Topologie konstruiert. Dies beweist die Leistungsfähigkeit der Plattform zur Generierung strukturell vielfältiger cyclischer Peptidbibliotheken.

04 Schlussfolgerung und Zukunftsperspektiven

In dieser Studie wurde erfolgreich eine Klasse unnatürlicher Aminosäurebausteine ​​mit einem stabilen hypervalenten Iod-(EBx)-Kern entwickelt und deren hervorragende Kompatibilität mit der Festphasen- und Lösungsphasen-Peptidsynthese systematisch demonstriert. Der zentrale Vorteil dieser Strategie liegt in der Möglichkeit, eine einzelne, hochreaktive EBx-Gruppe präzise und ortsspezifisch an jeder beliebigen Position innerhalb komplexer Peptidsequenzen einzuführen. Darauf aufbauend entwickelten die Forscher verschiedene milde und effiziente Cyclisierungsmethoden zur Synthese strukturell und topologisch vielfältiger monocyclischer und bicyclischer Peptide. Dabei wurden zentrale Probleme traditioneller Cyclisierungsmethoden wie die schwierige Kontrolle der Cyclisierungsposition, die erforderlichen aggressiven Reaktionsbedingungen und die begrenzte Diversität gelöst.

Die herausragende Bedeutung dieser Arbeit liegt darin, dass sie ein hypervalentes Iodreagenz, das ursprünglich als zu reaktiv und schwer in mehrstufige Syntheseverfahren integrierbar galt, durch rationales Moleküldesign in einen robusten und zuverlässigen synthetischen Baustein verwandelt. Es handelt sich dabei nicht nur um ein zusätzliches Werkzeug zur Cyclisierung, sondern um ein neues Paradigma der „Vorinstallation einer universellen reaktiven Gruppe“ für die modulare Funktionalisierung und Cyclisierung von Peptiden. Zukünftig wird von dieser Plattform eine größere Bedeutung in folgenden Bereichen erwartet: ① Weitere Optimierung der Struktur des EBx-Kerns zur Verbesserung seiner Stabilität bei der Synthese ultralanger Peptidketten; ② Anwendung solcher EBx-Peptide zur ortsspezifischen Modifizierung und Biokonjugation von Proteinen; ③ Integration mit Hochdurchsatz-Screening-Technologien wie genetisch kodierten Peptidbibliotheken und mRNA-Display zur schnellen Erstellung und zum Screening makrozyklischer Peptidbibliotheken auf Basis der EBx-Cyclisierung, um neuartige Leitstrukturen für bisher schwer zugängliche Zielstrukturen zu entdecken. Zusammenfassend bietet diese Arbeit Chemikern und chemischen Biologen ein leistungsstarkes und flexibles Werkzeug, das die Bereiche der cyclischen Peptidsynthese und der Wirkstoffforschung maßgeblich voranbringt.

Originalartikel: Liu, Xing‐Yu, et al. „Hypervalente Iod-Aminosäure-Bausteine ​​für die bioorthogonale Peptidmakrozyklisierung.“Angewandte Chemie International Edition63.33 (2024): e202404747.