„Präzision auf zwei Rädern: Strukturelle Verfeinerung von 68Ga-markierten bicyclischen Peptiden, die auf Nectin-4 abzielen, zur verbesserten Tumordarstellung: Von der präklinischen Entwicklung bis zur ersten Anwendung am Menschen“
Heute stellen wir eine Studie von Tobias Kronke et al. vor, die im Journal of Medicinal Chemistry veröffentlicht wurde. Diese Forschung konzentriert sich auf die Optimierung der Struktur von Nectin-4-gerichteten bicyclischen Peptiden zur Entwicklung von 68Ga-markierten Radioliganden für die Tumordiagnostik. Durch systematische Strukturmodifikationen (wie den bioisosteren Ersatz von Methionin) verbesserte die Studie nicht nur die radiochemische Reinheit und Stabilität der Liganden, sondern validierte auch erstmals deren Zielgenauigkeit in präklinischen Modellen und in einer ersten Anwendung am Menschen. Dies stellt ein neuartiges molekulares Werkzeug für die präzise Diagnose und Behandlung von Nectin-4-assoziierten Tumoren dar.
01 Forschungshintergrund
Nectin-4 ist ein Zelladhäsionsprotein, das in verschiedenen Tumoren (wie z. B. Urothelkarzinomen) stark exprimiert wird, in normalem adultem Gewebe (mit Ausnahme von embryonalem und plazentarem Gewebe) jedoch nur in geringem Maße vorkommt. Es hat sich zu einem wichtigen Zielmolekül für Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (z. B. Enfortumab Vedotin) und Peptidwirkstoffe (z. B. BT8009) entwickelt. In den letzten Jahren wurden bedeutende Fortschritte in der Nectin-4-gerichteten Therapie erzielt.
Klinischer Erfolg von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADCs): Enfortumab Vedotin (Padcev®), das erste gegen Nectin-4 gerichtete ADC, ist für die Behandlung des lokal fortgeschrittenen oder metastasierten Urothelkarzinoms zugelassen, insbesondere in Kombination mit dem PD-1-Inhibitor Pembrolizumab als Erstlinientherapie. Es nutzt einen spaltbaren Linker, um einen monoklonalen Anti-Nectin-4-Antikörper mit dem Tubulin-Inhibitor MMAE zu konjugieren und so eine präzise Zytotoxizität zu erzielen.
Entwicklung von Peptid-Wirkstoff-Konjugaten (PDCs): BT8009 (Zelenectid Vedotin) ist ein neuartiges bicyclisches Peptid-Wirkstoff-Konjugat, das denselben spaltbaren Linker und dieselbe zytotoxische Nutzlast (MMAE) wie Enfortumab Vedotin verwendet, jedoch das bicyclische Peptid BCY8126 als Zielstruktur nutzt (Abbildung 1). Präklinische Daten zeigen eine ausgezeichnete Antitumoraktivität, und es befindet sich derzeit in klinischen Studien für Urothelkarzinom und Brustkrebs (NCT06225596, NCT06840483).
Abbildung 1. Strukturen von BT8009 und BCY8126.
Eine zentrale Herausforderung in der aktuellen klinischen Praxis ist die Heterogenität und die dynamischen Veränderungen der Nectin-4-Expression. Kliumper et al. fanden kürzlich heraus, dass die Nectin-4-Expression in Metastasen im Vergleich zu Primärtumoren häufig signifikant reduziert oder sogar nicht nachweisbar ist, was mit einer verminderten Wirksamkeit von Enfortumab Vedotin einhergeht. Daher ist die nicht-invasive und präzise Quantifizierung der Nectin-4-Expression im gesamten Körper vor und während der Behandlung ein dringendes klinisches Bedürfnis für die Patientenstratifizierung, die Wirksamkeitsprognose und die Resistenzüberwachung. Obwohl antikörperbasierte ImmunoPET-Strategien erforscht wurden, schränken die pharmakokinetischen Eigenschaften großer Moleküle – wie langsame Blutclearance, geringe Tumordurchdringung und hohes Hintergrundsignal – deren Bildqualität und Anwendung ein. Im Gegensatz dazu bieten bizyklische Peptide als neuartiger Molekültyp ein optimales Verhältnis zwischen Größe und Funktion.
Mittleres Molekulargewicht (~2 kDa): Vereint gute Gewebepenetration mit schneller renaler Clearance.
Hohe Affinität und Spezifität: Selektiert durch Techniken wie Phagen-Display, was eine hochspezifische Zielbindung ähnlich wie bei Antikörpern ermöglicht.
Ausgezeichnete Stabilität: Die zyklische Struktur widersteht wirksam dem Abbau durch Proteasen.
Hohe Modifizierbarkeit: Geeignet für Strukturoptimierung und Radionuklidkonjugation durch chemische Synthese.
Ziel dieser Studie ist die Umwandlung des bicyclischen Peptid-Targeting-Kopfes (BCY8126) des klinisch entwickelten PDC-Arzneimittels BT8009 in einen exzellenten Radioliganden. Im Mittelpunkt steht die Behebung eines zentralen Problems der chemischen Instabilität: Der Methioninrest (Met) in der BCY8126-Sequenz ist während der Peptidsynthese und der Radiomarkierung stark anfällig für die Oxidation zu Methioninsulfoxid. Dies führt zu reduzierter Ausbeute, geringerer radiochemischer Reinheit und potenzieller Beeinträchtigung der Bindungsaktivität. Daher untersuchte das Team systematisch bioisostere Alternativen für Methionin, um stabilere und zuverlässigere Nectin-4-PET-Bildgebungssonden zu entwickeln und diese von der präklinischen Forschung bis zur ersten Anwendung am Menschen zu bringen.
02 Innovative Highlights
Erste systematische Bewertung des Einflusses von Methionin-Bioisosteren auf die Stabilität und Bindungsaffinität bicyclischer Peptide: Innovative Substituenten wie Norleucin (Nle), Methoxinin (Mox) und S-Ethylcystein wurden eingeführt, um das Oxidationsrisiko von Methionin (Met) während der Synthese und Markierung zu minimieren. Dadurch wurde die radiochemische Reinheit deutlich verbessert, während gleichzeitig eine hohe Affinität zu Nectin-4 erhalten blieb.
Multidimensionale Bindungscharakterisierungstechniken enthüllen Struktur-Wirkungs-Beziehungen: Mithilfe von Fluoreszenzanisotropie-(FA)-kompetitiven Bindungsassays und Oberflächenplasmonenresonanz-(SPR)-Kinetikanalysen zeigte die Studie erstmals, dass der Austausch von 1-Naphthylalanin (1NaI) durch 2-Naphthylalanin (2NaI) zu einer 30-fachen Verringerung der Affinität führte, hauptsächlich aufgrund einer reduzierten Assoziationsrate (k).An) und bildet damit eine wichtige Grundlage für die nachfolgende Optimierung.
Umfassende Validierung von der präklinischen Phase bis zur ersten Anwendung am Menschen: Systematischer Vergleich der Pharmakokinetik von 64Cu/68Ga-markierte Liganden aus In-vitro-Zellmodellen (HT-1376) für die In-vivo-PET-Bildgebung. Erstmals wurde die erfolgreiche Bildgebung von [68Ga]Ga-NECT-224 (dem optimierten Liganden basierend auf Mox-Substitution) bei einem Patienten mit metastasiertem Urothelkarzinom beschrieben, wodurch dessen klinisches Anwendungspotenzial bestätigt wurde.
03 Ergebnisse und Diskussion
3.1 Design von Peptidbibliotheken und Charakterisierung der Bindungsaffinität
In der Studie wurde zunächst eine Bibliothek bicyclischer Peptide basierend auf der BCY8126-Vorlage synthetisiert (Abbildung 2), wobei der Fokus auf der Modifizierung der Met4-Position lag (z. B. Verbindungen 1e-Met, 3a-Nle, 4-Mox usw.). Anschließend wurde deren Bindungsfähigkeit an rekombinantes humanes Nectin-4 mittels Fettsäure-Wettbewerbsassays untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die KDDDie Werte für Mox (4) und Nle (3a) (1,64 nM bzw. 1,04 nM) waren vergleichbar mit dem nativen Met (1e, K).D=0,77 nM), wohingegen die doppelte Substitution 2NaI/Arg5 (8a) zu einer signifikanten Abnahme der Affinität führte (KD=21,0 nM). Die SPR-Kinetik bestätigte weiterhin, dass die Affinitätsunterschiede primär auf Änderungen der Assoziationsrate zurückzuführen sind (Abbildung 3).
Abbildung 2. Übersicht über die Strukturen der hier untersuchten bicyclischen Peptide.
Abbildung 3. Bindung von Peptiden an rekombinantes humanes Nectin-4.
3.2 Radiomarkierung und Optimierung der oxidativen Stabilität
In 64Mit/68Bei Ga-Markierungsexperimenten wurde das Met-haltige Peptid (1e) während des Markierungsprozesses teilweise zu Methioninsulfoxid (2) oxidiert, was zur Bildung radioaktiver Nebenprodukte führte (Abbildung 4). Im Gegensatz dazu waren die chromatographischen Peaks für markiertes Mox (4) und Nle (3a) symmetrisch und einzeln (Abbildung 4), was ihre verbesserte Oxidationsbeständigkeit belegt. H₂O₂-Belastungsexperimente zeigten weiterhin, dass die Halbwertszeit von [64Cu]Cu-4 (Mox) (6,87 h) war signifikant höher als das von [64Cu]Cu-1e (Met, 3,5 h) (Abbildung 5).
Abbildung 4. Radio-HPLC-Analyse nach 64Mit und 68Ga-Markierung verschiedener Peptide.
Abbildung 5. Zeitabhängiger Abbau ausgewählter radioaktiv markierter Peptide in Gegenwart von H2DER2.
3.3 In-vitro-Zellbindung und Internalisierungsmechanismus
In Nectin-4-überexprimierenden HT-1376-Zellen, [64Cu]Cu-4 zeigte eine schnelle Bindung und anhaltende Internalisierung: Nach 60 Minuten Inkubation waren 70 % des Liganden säureresistent (d. h. internalisiert), und dieser Prozess konnte auch bei 4 °C noch stattfinden, was auf einen möglichen nicht-klassischen endozytischen Weg hindeutet. Sättigungsbindungsexperimente ergaben einen KD-Wert.Dvon 3,2 nM für [64Cu]Cu-4, im Einklang mit den SPR-Daten (Abbildung 6).
Abbildung 6. Zellbindung und Internalisierung der gegen Nectin-4 gerichteten Radioliganden.
3.4 In-vivo-PET-Bildgebung und Pharmakokinetik
PET-Bildgebung an Tieren zeigte, dass [64Cu]Cu-4 zeigte die höchste Aufnahme in HT-1376-Tumoren (SUV-Mittelwert des Peaks 1,0), und das Tumor-zu-Muskel-Verhältnis war anderen Liganden überlegen (Abbildung 7). Obwohl die anfängliche Aufnahme von [68Ga]Ga-4 war etwas niedriger, zeigte aber eine gute Tumorretention. In der ersten Anwendung am Menschen [68Ga]Ga-NECT-224 detektierte erfolgreich Hirnmetastasen, Lymphknoten und die Primärläsion (Abbildung 8), wobei ein SUVmax von 23,8 (Nierenbeckentumor) erreicht wurde, was seinen klinischen Wert unterstreicht.
Abbildung 7. PET-Bilder und bildbasierte Aufnahmewerte der 64Cu-markierte Nectin-4-Liganden.
Abbildung 8. Erste Anwendung am Menschen von [68Ga]Ga-4 ([68(Ga-NECT-224).
04 Schlussfolgerung
In dieser Studie wurden durch Strukturoptimierung erfolgreich neuartige, auf Nectin-4 abzielende bicyclische Peptid-Radioliganden entwickelt. Die Methoxinin-(Mox)-Austauschstrategie verbesserte die Oxidationsbeständigkeit und die radiochemische Reinheit signifikant.64Cu]Cu-NECT-224 und [68Ga]Ga-NECT-224 zeigte in präklinischen Modellen eine ausgezeichnete Tumorzielsicherheit, und die erste Anwendung am Menschen bestätigte die klinische Anwendbarkeit. Zukünftige Arbeiten sollten sich auf die Reduzierung der Dissoziationsrate (k) konzentrieren.aus) um die Tumorretention zu verlängern und Bildgebungsstudien mit der längeren Halbwertszeit zu fördern. 64Cu-markierte Version. Diese Studie fördert nicht nur die Entwicklung von Nectin-4-Bildgebungssonden, sondern liefert auch ein Paradigma für das rationale Design von bicyclischen Peptiden mit breitem translationalem Potenzial.
Originalartikel:
Krönke T, Trommer J, Ullrich M, et al. „Präzision auf zwei Rädern“ – Strukturelle Verfeinerung von 64Cu- und 68Ga-markierten bicyclischen Peptiden, die auf Nectin-4 abzielen, zur Verbesserung der Tumordarstellung: Von der präklinischen Entwicklung zur ersten Anwendung am Menschen [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2025.