„Thiol-En-Photoklick-Chemie für die effiziente Synthese bicyclischer Peptide und die Erstellung einer genetisch kodierten Peptidbibliothek“

Heute stellen wir Ihnen eine wichtige Forschungsarbeit des Teams um Xinxiang Lei von der Universität Lanzhou vor, die in der Angewandten Chemie International Edition veröffentlicht wurde. Diese Arbeit stellt die erste Anwendung der Thiol-En-Photoklick-Chemie zur effizienten Bicyclisierung ungeschützter Peptide dar und entwickelt eine schnelle, hochselektive und biokompatible neue Methode. Die Forscher nutzten den kostengünstigen und leicht verfügbaren Trialken-Vernetzer TAIC. Unter sichtbarem Licht ist die Cyclisierung in nur 6 Minuten abgeschlossen. Sie kombinierten dies erfolgreich mit der Phagen-Display-Technologie, um eine genetisch kodierte Bibliothek bicyclischer Peptide zu erstellen und nach neuen Liganden mit ultrahoher sub-mikromolarer Affinität zum wichtigen Wirkstoffziel Cyclophilin A zu suchen. Diese Studie bietet eine leistungsstarke und vielseitige neue Plattform für die Entdeckung von Peptidwirkstoffen mit eingeschränkter Struktur.

01 Forschungshintergrund

Bicyclische Peptide besitzen aufgrund ihrer einzigartigen starren Struktur und exzellenten Stabilität ein immenses Potenzial für die gezielte Beeinflussung von Protein-Protein-Interaktionen (PPIs), die für niedermolekulare Verbindungen traditionell schwer zugänglich sind. Sie haben sich zu einem wichtigen Grundgerüst in der Wirkstoffforschung entwickelt. Ihre Weiterentwicklung wurde jedoch lange durch den Mangel an effizienten, hochselektiven Cyclisierungsmethoden behindert. Traditionelle Methoden, wie die Verwendung von Vernetzern wie TBMB, stoßen häufig auf Probleme wie aggressive Reaktionsbedingungen, zahlreiche Nebenreaktionen und geringe Kompatibilität mit komplexen biologischen Umgebungen, was ihre Anwendung auf Hochdurchsatz-Screening-Plattformen wie dem Phagen-Display erschwert. Obwohl in der Folge verbesserte Strategien wie metallvermittelte Ansätze entwickelt wurden, bestehen weiterhin Probleme wie Metalltoxizität und Ligandenstabilität. Daher ist die Entwicklung einer neuen Methode, die eine schnelle, spezifische Peptid-Bicyclisierung unter milden, physiologisch verträglichen Bedingungen ermöglicht, ein dringendes Bedürfnis in der chemischen Biologie und der Wirkstoffforschung. Die Thiol-En-Photoklick-Chemie ist bekannt für ihre Geschwindigkeit, Effizienz und exzellente räumliche und zeitliche Kontrolle. Ziel dieser Studie ist es, sie als innovatives Werkzeug zur Lösung dieses zentralen Problems weiterzuentwickeln.

02 Innovative Highlights

• Erste Anwendung der Thiol-En-Photoclick-Chemie zur Peptid-Bicyclisierung: Das Forschungsteam wählte den kommerziell erhältlichen Trialken-Vernetzer TAIC. Mithilfe eines kostengünstigen Photoinitiators und unter mildem Licht gelang ihnen die effiziente und hochselektive Cyclisierung von drei Cystein-Thiolen an ungeschützten Peptiden über einen radikalischen Mechanismus. Die Reaktion verläuft quantitativ in nur 6 Minuten unter milden Bedingungen, die mit allen proteinogenen Aminosäuren kompatibel sind.

• Perfekte Kompatibilität mit Phagen-Display ermöglicht die Erstellung einer genetisch kodierten bicyclischen Peptidbibliothek: Dies ist ein entscheidender Durchbruch der Arbeit. Die Forscher optimierten die Photocyclisierungsbedingungen, um die Lebensfähigkeit der Phagen so wenig wie möglich zu beeinträchtigen. Erstmals gelang ihnen die In-situ-Bicyclisierung von linearen Peptiden direkt auf der Oberfläche von Phagenpartikeln. Dadurch wurde die präzise Kontrollierbarkeit der chemischen Synthese optimal mit dem hohen Durchsatz des biologischen Screenings kombiniert.

• Erfolgreiche Entdeckung hochaffiner Leitstrukturen: Mithilfe dieser Plattform für das Screening gegen das wichtige Wirkstoffziel Cyclophilin A konnten bicyclische Peptidliganden mit Bindungskonstanten im sub-mikromolaren Bereich erfolgreich synthetisiert werden. Ihre Affinität war im Vergleich zu linearen Vorstufen um ein Vielfaches höher, und sie zeigten eine signifikant erhöhte Proteaseresistenz, was den praktischen Nutzen der Methode unterstreicht.

Abbildung 1. a) Konventionelle Cyclisierungsstrategien zur Bildung bicyclischer Peptide. b) Synthese bicyclischer Peptide mittels Thiol-En-Photoclick-Chemie und deren Anwendung beim Aufbau einer Phagen-basierten Bibliothek bicyclischer Peptide.

03 Ergebnisse und Diskussion

3.1 Systematische Optimierung der Reaktionsbedingungen und mechanistische Überprüfung

Die Studie optimierte zunächst systematisch das Thiol-En-Photoclick-Reaktionssystem. Durch Screening von Vernetzern und Photoinitiatoren wurde die wasserlösliche Trialkenverbindung TAIC als idealer Vernetzer identifiziert, wobei Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat als Photoinitiator diente. Die höchste Ausbeute wurde durch Reaktion in einem Acetonitril/Wasser-Gemisch unter UV-Bestrahlung (365 nm) über 6 Minuten erzielt. Kontrollexperimente bestätigten, dass die Reaktion in Abwesenheit von Licht, Photoinitiator oder in Gegenwart des Radikalfängers TEMPO vollständig gehemmt wird. Dies klärt den Radikalmechanismus auf und liefert eine verlässliche chemische Grundlage für nachfolgende Anwendungen.

Abbildung 2. a) Bicyclisierung des linearen Peptids 5a mittels Thiol-En-Photoklick-Reaktion. b) HPLC-Analyse (220 nm) von Peptid 5a nach Thiol-En-Photoklick-Reaktion im Lösungsmittelsystem H₂O/MeCN (v/v, 80:20). c) HPLC-Analyse (220 nm) von Peptid 5a nach Thiol-En-Photoklick-Reaktion in verschiedenen Puffer/MeCN-Mischungen (v/v, 80:20). d) Bicyclisierung des linearen Peptids 5b mittels Thiol-En-Photoklick-Reaktion und TBMB-Vernetzung. e) Vergleichende HPLC-Analyse (220 nm) von Peptid 5b nach Cyclisierung mittels Thiol-En-Photoklick-Reaktion und TBMB.

3.2 Universalität der Bicyclisierung und Vergleich mit traditionellen Methoden

Unter optimalen Bedingungen zeigte diese Strategie eine breite Substratanwendbarkeit. Eine Reihe linearer Peptide mit drei Cysteinresten, unterschiedlicher Sequenzlänge und Spacer, wurde effizient in die entsprechenden bicyclischen Peptide überführt. Im Vergleich zur Alkylierungsmethode mit dem traditionellen Vernetzer TBMB wies diese Photocyclisierungsstrategie deutliche Vorteile hinsichtlich Reaktionsgeschwindigkeit, Ausbeute und Nebenproduktkontrolle auf. Die HPLC-Analyse ergab, dass die Photoklick-Methode eine schnelle Bicyclisierung mit hoher Ausbeute und minimalen Nebenprodukten ermöglichte, während die TBMB-Methode eine geringere Ausbeute und ein komplexes Produktgemisch lieferte. Dies unterstreicht die Überlegenheit der Photoklick-Chemie.

Abbildung 3. Substratspektrum der Peptidbicyclisierung.

3.3 Überprüfung der Biokompatibilität sowie Konstruktion und Screening von Phagenbibliotheken

Um das Potenzial für biologische Anwendungen zu überprüfen, wurde die Kompatibilität mit Proteinen und Phagen untersucht. Experimente zeigten, dass unter optimierten Bedingungen (150 μM TAIC, 75 μM Photoinitiator, 365 nm Licht für 6 Minuten) die Infektiosität des Phagen nicht signifikant beeinträchtigt wurde und seine Aktivität deutlich besser erhalten blieb als bei der herkömmlichen TBMB-Behandlung. Diese hervorragende Biokompatibilität ermöglichte die erfolgreiche Erstellung einer umfangreichen Phagen-präsentierten Bibliothek bicyclischer Peptide (Bibliotheksgröße ~10⁹) und deren erfolgreiche Anwendung im Hochdurchsatz-Ligandenscreening gegen das therapeutisch relevante Zielmolekül Cyclophilin A.

Abbildung 4. Validierung der Biokompatibilität sowie Konstruktion und Screening der Phagenbibliothek.

3.4 Identifizierung und Leistungscharakterisierung von Liganden mit hoher Affinität

Durch Phagenbibliothek-Screening wurden die hochaffinen bicyclischen Peptide CM1 und CM2 gegen Cyclophilin A identifiziert. Oberflächenplasmonenresonanz-Analysen zeigten, dass CM1 im Vergleich zu seinem linearen Vorläufer M1 eine signifikant höhere Bindungsaffinität aufwies, wobei die Gleichgewichtskonstante der Dissoziation von mikromolaren Werten auf 364 nM anstieg. CM1 zeigte zudem eine ausgezeichnete Stabilität in Mausplasma mit einer Halbwertszeit, die die des linearen Peptids deutlich überstieg. Weiterführende Kernspinresonanz-Titrationsexperimente ergaben, dass CM1 in der Nähe der aktiven Tasche von Cyclophilin A bindet. Die chemischen Verschiebungen von CM1 korrelieren stark mit bekannten Aminosäureresten der aktiven Tasche, was die hohe Spezifität von CM1 aus struktureller Sicht erklärt.

04 Schlussfolgerung und Zukunftsperspektiven

Diese Studie entwickelte erfolgreich eine effiziente und vielseitige Plattform zur Peptid-Bicyclisierung auf Basis der Thiol-En-Photoclick-Chemie. Durch die Nutzung ihrer Vorteile hinsichtlich Effizienz, Selektivität und Biokompatibilität überwindet sie nicht nur die Einschränkungen traditioneller Methoden, sondern erzielt – und das ist besonders wichtig – durch die Integration mit der Phagen-Display-Technologie eine Synergie zwischen Photochemie und biologischem Screening. Dies eröffnet neue Wege für die großtechnische Entdeckung hochaffiner bicyclischer Peptidliganden und die Erforschung bisher als „nicht medikamentös behandelbar“ geltender Zielstrukturen. Zukünftig bietet diese Plattform vielversprechende Möglichkeiten zur Erweiterung auf fortgeschrittene Screening-Technologien wie mRNA-Display und In-vivo- oder In-situ-Cyclisierungsverfahren. Durch die Kombination der präzisen Kontrolle der chemischen Synthese mit dem hohen Durchsatz des biologischen Screenings hat sie das Potenzial, sich zu einer Standardplattform für die Peptidwirkstoffentwicklung zu entwickeln. Sie zeigt besonders breite Perspektiven bei der Untersuchung komplexer Protein-Protein-Interaktionen, verleiht der Entwicklung von Peptidtherapeutika der nächsten Generation neue Impulse und wird voraussichtlich eine bedeutende Rolle in der Biomolekulartechnik und der Arzneimittelentwicklung spielen.

Originalartikel:

Ming, Wei, et al. „Thiol–En-Photoclick-Chemie für die effiziente Synthese bicyclischer Peptide und die genetisch kodierte Peptidbibliothek.“Angewandte Chemie International Edition(2025): e18628.

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202518628