Cyclisation contrôlée et synthèse ribosomale : la naissance d’une nouvelle génération de plateformes peptidiques bicycliques

Aujourd'hui, nous partageons une importante étude de l'équipe du professeur Hiroaki Suga de l'Université de Tokyo, publiée dans Angewandte Chemie International Edition et intitulée « Synthèse ribosomique de peptides bicycliques à pont thioisoindole topologiquement définis ». Cette étude a permis de développer une nouvelle stratégie de synthèse de peptides bicycliques basée sur la formation de ponts thioisoindole. En concevant un acide aminé 2-nicotinoylbenzaldéhyde protégé par une semicarbazone (Ac-Ala(NtBA)Sc-CME) comme initiateur de traduction, celui-ci a été efficacement incorporé dans des chaînes peptidiques grâce à un système de traduction in vitro flexible (FIT). Un traitement acide doux a ensuite déclenché une réaction de bicyclisation intramoléculaire, permettant la construction de peptides bicycliques de structure précise. Cette méthode est entièrement compatible avec la technologie d'affichage sur ARNm, offrant ainsi une plateforme performante pour la construction de vastes banques de peptides bicycliques topologiquement définis, destinées à la découverte de médicaments.

Figure 1. Aperçu schématique de cette étude : construction ribosomale de peptides bicycliques pontés par thioisoindole (TiB).

01 Contexte de la recherche

Les peptides macrocycliques sont devenus des structures de base importantes en découverte de médicaments grâce à leur rigidité et à leur fort potentiel de ciblage. Cependant, les méthodes traditionnelles de construction de banques de peptides macrocycliques (par exemple, la cyclisation par pont disulfure) souffrent d'une faible stabilité métabolique et d'une diversité structurale limitée. Bien que la technologie d'affichage sur ARNm permette le criblage de banques extrêmement vastes (>10^12), les stratégies de cyclisation existantes (reposant principalement sur l'attaque nucléophile de la cystéine ou la formation de ponts disulfure) peinent à générer des peptides bicycliques structurellement stables et topologiquement définis. Si la chimie de l'ortho-phtalaldéhyde (OPA) permet la cyclisation via la formation de structures thioisoindoles, sa forte réactivité conduit souvent à des réactions secondaires non spécifiques et n'est pas directement applicable aux systèmes de traduction in vitro. Par conséquent, le développement d'une nouvelle méthode compatible avec l'affichage sur ARNm, offrant une forte contrôlabilité et capable de générer des structures bicycliques stables, est devenu une nécessité urgente dans ce domaine.

02 Points forts innovants

• Développement d'un nouvel initiateur de traduction à réactivité ajustable :

L'équipe de recherche a conçu trois analogues de la phénylalanine dérivés du 2-cétobenzaldéhyde (AcBA, NtBA, BzBA). L'introduction de substituants (par exemple, un groupe nicotinoyle) pour réduire la réactivité du fragment OPA a permis d'éviter les réactions secondaires avec les composants libres du système de traduction. Parallèlement, un groupe semicarbazone a été utilisé comme groupe protecteur réversible, assurant la stabilité de l'initiateur pendant la traduction et permettant une déprotection sélective par traitement acide doux après la traduction afin de déclencher la cyclisation.

• Établissement d'une voie de couplage Negishi efficace :

En optimisant les conditions de la réaction de couplage croisé de Negishi catalysée par le palladium (système Pd₂(dba)₃/SPhos), l'équipe a réussi à former la liaison carbone-carbone sans protéger le groupe aldéhyde, synthétisant ainsi l'intermédiaire clé Ac-Ala(NtBA)CHO-OMe avec un rendement de 67 % tout en préservant la pureté chirale. Cette méthode offre une nouvelle voie de synthèse pour des structures analogues.

• Réalisation de la synthèse ribosomique « en une seule étape » de peptides bicycliques :

L'initiateur optimal Ac-Ala(NtBA)Sc-CME a été efficacement chargé sur l'ARNt via la flexizyme et incorporé à l'extrémité N-terminale de la chaîne peptidique grâce au système FIT. Après traduction, l'ajout simultané d'un tampon citrate (pH 4) et de pyruvate a permis la déprotection de la semicarbazone et la bicyclisation intramoléculaire, formant ainsi une structure bicyclique pontée par un groupe 3-(pyridin-3-yl)-1-thioisoindole.

03 Résultats et discussion

3.1 Conception de l'initiateur et optimisation synthétique

Grâce à une conception rationnelle, l'équipe a modifié la structure de l'OPA en 2-nicotinoylbenzaldéhyde (NtBA), réduisant considérablement son électrophilie, tout en introduisant le groupe protecteur semicarbazone pour assurer la compatibilité de traduction (Figure 2).

Figure 2. a) Conception du dérivé dicarbonyl-phénylalanine (2CO-Phe) pour l'aminoacylation par flexizyme. b) Illustration schématique de la synthèse ribosomique de peptides bicycliques pontés par thioisoindole (TiB) à l'aide d'un initiateur de traduction conçu dans un système FIT génétiquement reprogrammé.

3.2 Aminoacylation efficace de l'initiateur de traduction

Les expériences de charge d'ARNt médiées par Flexizyme ont montré que l'Ac-Ala(NtBA)Sc-CME atteignait une efficacité de charge quasi quantitative à une concentration de 25 mM (Figure 3), surpassant l'initiateur couramment utilisé ClAc-Trp, prouvant ainsi son efficacité en tant que substrat d'initiation de traduction très efficace.

Figure 3. a) Synthèse du substrat central 1, Ac-Ala(NtBA)Sc-CME. b) Optimisation des conditions de couplage croisé de Negishi, avec mise en évidence des conditions de couplage finales. c) Structures chimiques des composés 7 et 8.

3.3 Optimisation des conditions de cyclisation et vérification de la compatibilité de l'ARNm

Le criblage a révélé qu'un tampon citrate 50 mM (pH 4) contenant 1 mM de pyruvate déclenchait efficacement la cyclisation à 37 °C. De plus, ces conditions préservaient l'intégrité de l'ARNm (Figure 4), répondant ainsi aux exigences de l'affichage de l'ARNm.

Figure 4. a) Aperçu schématique de la synthèse ribosomique du peptide TiB ck1 ; le panneau de droite montre les chromatogrammes de courant d'ions extraits (EIC) LC/MS et les spectres de masse correspondants.

3.4 Construction générale des banques de peptides bicycliques

Le test de 14 matrices présentant différentes séquences (espacement variable entre les résidus cystéine et lysine) a permis la conversion réussie de 12 d'entre elles en peptides bicycliques, avec des taux de conversion allant de 60 % à 98 % (Figure 5). Ces résultats indiquent que l'efficacité de cyclisation est indépendante de la longueur de la séquence et de l'agencement des résidus, ce qui démontre la robustesse de la stratégie.

Figure 5. a) et b) Séquences représentatives de peptides thioisoindole-bicycliques (TiB) synthétisés par les ribosomes.

04 Conclusion et perspectives d'avenir

Cette étude a permis de développer avec succès une nouvelle méthode de synthèse ribosomique de peptides bicycliques pontés par un thioisoindole. Grâce à la conception d'un initiateur de traduction à réactivité modulable et à une cyclisation post-traductionnelle douce, elle a permis la synthèse efficace et programmable de peptides bicycliques à topologie définie. Cette stratégie s'affranchit des limitations de stabilité et de compatibilité des méthodes de cyclisation traditionnelles et s'intègre parfaitement à la technologie d'affichage d'ARNm. À l'avenir, l'incorporation d'étiquettes de purification dans l'initiateur pourrait améliorer la qualité des banques de peptides, ou l'approche pourrait être étendue à la construction d'autres structures cycliques stables (par exemple, des ponts thiazoline). Ces travaux enrichissent non seulement la diversité chimique des banques de peptides, mais fournissent également un nouvel outil pour la découverte de ligands ciblant des protéines considérées comme « inaccessibles aux médicaments ».