Greffage d'hétérocycles imidazopyridinium pour améliorer la perméabilité membranaire des peptides cycliques
Cette fois-ci, nous partageons une étude publiée dans le Journal de la Société américaine de chimieIntitulée « Synthèse de peptides macrocycliques perméables aux membranes par greffage d'imidazopyridinium », cette recherche, menée par l'équipe de Thomas Kodadek, s'attaque à un obstacle majeur à l'application clinique des peptides macrocycliques (PM) : leur faible perméabilité membranaire. Pour ce faire, elle développe une nouvelle stratégie de synthèse en phase solide. Cette méthode permet de construire efficacement des structures macrocycliques contenant un motif imidazopyridinium en piégeant un intermédiaire imine intramoléculaire et en le faisant réagir avec la 2-formylpyridine (ou la 2-cétopyridine). Cette chimie est non seulement applicable à la synthèse de peptides macrocycliques de différentes tailles et géométries (tête-à-chaîne latérale, chaîne latérale-à-chaîne latérale), mais surtout, les peptides macrocycliques contenant IP⁺ ainsi obtenus présentent une perméabilité membranaire passive exceptionnelle, dépassant largement les attentes pour des molécules respectant la « règle des cinq ». L'étude démontre en outre que cette méthode convient à la construction de banques de peptides macrocycliques et permet un criblage réussi des ligands protéiques, offrant ainsi une nouvelle plateforme puissante pour le développement de médicaments peptidiques macrocycliques ciblant des cibles intracellulaires.
01 Contexte de la recherche
Les peptides macrocycliques (PM) suscitent un intérêt considérable en tant que sondes et composés de tête pour le ciblage de protéines complexes (par exemple, celles possédant des poches de liaison peu profondes). Bien que diverses technologies efficaces existent pour la synthèse et le criblage de banques de peptides macrocycliques (par exemple, le phage display, le mRNA display, les banques codées par ADN), leur application clinique reste limitée par une faible perméabilité membranaire et une faible biodisponibilité. Les stratégies courantes pour améliorer la perméabilité membranaire consistent à imiter des produits naturels comme la cyclosporine en « masquant » la polarité des liaisons peptidiques par N-méthylation ou en formant des liaisons hydrogène intramoléculaires. Cependant, il est urgent de développer de nouvelles réactions de macrocyclisation efficaces dans des conditions douces, permettant d'introduire de nouveaux groupements fonctionnels et conférant simultanément une perméabilité membranaire élevée. Le groupe imidazopyridinium (IP⁺), hétérocycle aromatique hydrophobe et chargé positivement en permanence, est prometteur pour faciliter le transport transmembranaire par attraction électrostatique et interactions hydrophobes. Cette étude vise à explorer l'utilisation des réactions de formation d'IP⁺ pour parvenir à une synthèse efficace de peptides macrocycliques et à évaluer systématiquement son impact révolutionnaire sur l'amélioration de la perméabilité membranaire des peptides.
02 Points forts innovants
2.1 Méthode de cyclisation : Première introduction du motif IP⁺ dans des peptides macrocycliques, développement d’une nouvelle réaction de synthèse en phase solide efficace
Ce travail propose et valide, pour la première fois, une nouvelle stratégie de macrocyclisation : l’utilisation d’un motif glycolaldéhyde N-terminal (généré par oxydation de la sérine par NaIO₄) sur une chaîne peptidique synthétisée en phase solide pour former une imine intramoléculaire avec l’ε-amine d’une lysine de chaîne latérale. Cette imine est ensuite piégée par la 2-formylpyridine (ou ses dérivés) pour former, en une seule étape, un cycle stable ponté par un imidazopyridinium. Les conditions réactionnelles sont douces (50 % AcOH/TFE, 30 °C), les rendements sont élevés (souvent quasi quantitatifs) et les réactions secondaires intermoléculaires sont minimales, ce qui rend cette méthode parfaitement adaptée aux exigences de la synthèse en phase solide.
2.2 Percée majeure en matière de performances : les peptides macrocycliques IP⁺ présentent une perméabilité membranaire passive exceptionnellement élevée
L'évaluation systématique par le test de perméabilité sur membrane artificielle parallèle (PAMPA) a révélé qu'environ 45 % des peptides macrocycliques IP⁺ synthétisés (masse moléculaire de 650 à 850 Da) présentaient une excellente perméabilité membranaire passive, avec des taux de perméation comparables à ceux des médicaments classiques de faible masse moléculaire (par exemple, le propranolol). Même les peptides macrocycliques de masse moléculaire supérieure à 1 000 Da ont montré une perméabilité modérée. Des expériences comparatives (en remplaçant le pont IP⁺ par des groupements neutres comme l'amide ou le thioéther) ont confirmé que le motif IP⁺ est le facteur clé conférant cette perméabilité membranaire ultra-élevée. Sa charge positive permanente et sa structure aromatique hydrophobe favorisent probablement de manière synergique l'association membranaire et le transport transmembranaire.
2.3 Application : Démonstration de l'adéquation à la construction de bibliothèques à haut débit et au criblage de ligands
L'étude a permis la synthèse parallèle de 100 peptides macrocycliques IP⁺ à l'échelle micrométrique (2 mg de résine/puits) dans une plaque de microfiltration à 96 puits, la majorité des produits présentant une pureté supérieure à 85 %. Ceci démontre l'applicabilité de la méthode à la construction de chimiothèques combinatoires. À titre de preuve de concept, l'équipe a construit une chimiothèque modèle de 480 composés ciblant la streptavidine (SA) et a identifié avec succès un nouveau ligand de la SA (MP29, Kᴅ ≈ 7,0 µM) par criblage sur billes, soulignant ainsi l'intérêt pratique de la plateforme pour la découverte d'inhibiteurs d'interactions protéine-protéine.
2.4 Réalisation de l’« agrafage » des peptides et ajustement précis de l’hélicité :
Cette méthode peut être appliquée avec souplesse au « stapping » de peptides. Prenant pour exemple un peptide ligand de la protéine de capside du VIH, imperméable aux cellules, le stapping par chimie IP⁺ à différentes positions (i, i+4 ou i, i+7) a permis d'obtenir des dérivés présentant une hélicité nettement accrue. De manière intéressante, l'utilisation de différents dérivés de 2-formylpyridine pour le stapping permet un ajustement précis de l'hélicité du peptide stapping résultant, offrant ainsi une nouvelle perspective pour l'optimisation de la conformation et de l'activité peptidiques.
03 Résultats et discussion
Grâce à une synthèse systématique, une caractérisation, un criblage et des tests de perméabilité, l'étude a validé de manière exhaustive la faisabilité, la généralité et les avantages uniques de la stratégie de cyclisation IP⁺.
3.1 Étendue du substrat de la réaction de macrocyclisation IP⁺ et taille optimale du cycle
L'étude a d'abord vérifié la faisabilité de la réaction à l'aide du peptide modèle MP1, obtenant un rendement quasi quantitatif et une pureté élevée. Elle a ensuite évalué systématiquement la portée du composant pyridine : les 2-formylpyridines contenant des groupements électrodonneurs (méthyle, méthoxy, pipéridinyle, etc.) ou des cycles condensés (quinoléine) se sont toutes révélées d'excellents substrats, conduisant à des peptides macrocycliques avec un rendement supérieur à 85 % ; la 2-cétopyridine a également réagi efficacement, élargissant encore la diversité des substrats. Des études sur la taille des cycles ont indiqué que cette chimie est optimale pour la formation de macrocycles contenant 15 à 24 atomes (à partir d'acides aminés standards). En introduisant des espaceurs flexibles (par exemple, Ahx, Ipa), des peptides macrocycliques comportant jusqu'à 37 à 39 atomes (MP18, MP19) ont également pu être synthétisés efficacement.
3.2 Compatibilité étendue avec les acides aminés et chimie de liaison stable
La réaction de cyclisation est compatible avec les groupes protecteurs des chaînes latérales de tous les acides aminés protéinogènes, notamment Tyr, Trp, Arg, Lys, Cys, His, Glu, etc. La réaction se déroule en tampon acide (pH 4-5), évitant ainsi les réactions secondaires sensibles aux bases. La liaison IP⁺ générée a démontré une stabilité en conditions physiologiques (37 °C, 24 heures) face à divers nucléophiles (glutathion, 2-mercaptoéthanol, hydrazine, pipéridine) ainsi qu'à des agents oxydants/réducteurs et sur une large gamme de pH (1-11), répondant ainsi aux exigences des applications biologiques ultérieures.
3.3 Construction efficace des bibliothèques et sélection fonctionnelle
Pour démontrer sa capacité à construire des chimiothèques, l'étude a synthétisé en parallèle 100 peptides macrocycliques IP⁺ différents sur microplaque, en combinant 20 précurseurs linéaires différents avec 5 aldéhydes de pyridine différents. La grande majorité des produits étaient d'une pureté élevée, prouvant la robustesse et l'extensibilité de la méthode. De plus, l'équipe a construit une chimiothèque ciblée de 480 composés ciblant la streptavidine (SA). En détectant la liaison de la SA marquée par fluorescence à des billes, ils ont identifié avec succès le ligand à haute affinité MP29 et vérifié son affinité de liaison micromolaire (Kᴅ ≈ 7,0 µM) par des tests de compétition en solution, démontrant ainsi le potentiel de cette chimie pour la découverte de ligands fonctionnels.
3.4 Exploration préliminaire du mécanisme exceptionnel de perméabilité membranaire passive et validation de l'absorption cellulaire
Les tests PAMPA ont révélé l'extraordinaire perméabilité membranaire des peptides macrocycliques IP⁺, de nombreux composés dépassant largement les limites Ro5 et présentant une excellente perméabilité. Des expériences comparatives directes ont montré que le remplacement du pont IP⁺ dans MP36 par un pont amide ou thioéther neutre réduisait sa perméabilité d'un facteur 10 à 100, confirmant ainsi le rôle central du motif IP⁺. Différents dérivés d'aldéhyde de pyridine ont influencé significativement la perméabilité, suggérant qu'il est possible de l'optimiser davantage par des modifications structurales. Des expériences cellulaires préliminaires (test de pénétration des chloroalcanes, CAPA) ont indiqué que les peptides macrocycliques IP⁺ portant un marqueur de pénétration cellulaire pouvaient pénétrer efficacement dans des cellules vivantes exprimant HaloTag. Bien que leur efficacité de pénétration soit inférieure à celle d'une petite molécule témoin, ce résultat est très encourageant compte tenu de leur masse moléculaire beaucoup plus élevée.
04 Conclusion et perspectives d'avenir
Cette étude a permis de développer avec succès une méthode inédite, efficace et modulaire de synthèse de peptides macrocycliques basée sur la formation d'imidazopyridinium (IP⁺). Outre ses conditions réactionnelles douces, ses rendements élevés et sa large gamme de substrats, l'atout majeur de cette méthode réside dans l'amélioration significative de la perméabilité membranaire passive conférée par l'introduction du motif IP⁺. Ceci permet à de nombreux peptides macrocycliques, qui « dérogent à la règle des cinq », d'acquérir une capacité de translocation membranaire comparable à celle de petites molécules à visée thérapeutique. Associée à son aptitude à la construction et au criblage à haut débit de chimiothèques, cette méthode constitue une plateforme très prometteuse pour la découverte de médicaments peptidiques macrocycliques ciblant des cibles intracellulaires jusqu'alors considérées comme « inaccessibles aux médicaments ».
En résumé, l'avancée majeure de ce travail réside dans l'intégration directe d'un « module fonctionnel » aux propriétés physico-chimiques uniques (charge positive permanente et aromaticité hydrophobe) au sein de la structure peptidique macrocyclique, grâce à une réaction de cyclisation efficace, « encodant » ainsi une excellente perméabilité membranaire. Cette approche diffère des méthodes traditionnelles qui améliorent indirectement les propriétés en ajustant finement la séquence et la conformation du peptide, offrant ainsi une voie plus directe et généralisable. Les recherches futures pourraient s'orienter vers : ① L'étude approfondie de la relation structure-activité quantitative entre la structure de l'unité IP⁺ et la perméabilité membranaire afin de concevoir rationnellement des variantes présentant une perméabilité encore meilleure ; ② L'intégration de la chimie IP⁺ aux plateformes de criblage à très haut débit, telles que le mRNA display ou les banques d'ADN codées, pour la découverte à grande échelle de composés candidats ciblant des cibles intracellulaires ; ③ La validation de… in vivoactivité et potentiel thérapeutique des peptides macrocycliques IP⁺ dans des modèles de maladies plus complexes.
Li, Bo, et al. « Synthèse de peptides macrocycliques perméables à la membrane par greffage d'imidazopyridinium. »Journal de la Société américaine de chimie146.21 (2024) : 14633-14644.