Synthèse en phase liquide de tirzépatide assistée par un marqueur hydrophobe

Aujourd'hui, nous partageons un article de recherche important de l'équipe de Lin Dong, publié dans Organic Letters. Ce travail s'attaque aux difficultés liées au coût élevé et à la complexité des procédures de synthèse peptidique en phase solide (SPPS) pour le tirzépatide (un nouvel agoniste à double cible pour le traitement du diabète de type 2 et de l'obésité) en développant une nouvelle stratégie de synthèse peptidique en phase liquide (LPPS) assistée par des étiquettes hydrophobes. Cette méthode introduit des étiquettes hydrophobes solubles (TAGa et TAGb), tirant parti de leurs propriétés de solubilité uniques pour obtenir une séparation efficace, réduisant ainsi considérablement le gaspillage d'acides aminés et de solvants. Elle utilise également une stratégie de double protection (Cbz/Fmoc) sur la lysine pour contrôler précisément l'assemblage des chaînes latérales, permettant ainsi la synthèse réussie du tirzépatide (39 acides aminés) avec un rendement élevé. Ce travail offre une nouvelle approche pour la production à grande échelle, écologique et économique, de médicaments peptidiques complexes.

Figure 1. Structure de la tirzépatide.

01 Contexte de la recherche

Premier agoniste double des récepteurs GIP/GLP-1, la tirzépatide a démontré une efficacité remarquable dans le traitement du diabète et de l'obésité. Cependant, sa synthèse repose largement sur la synthèse peptidique en phase solide (SPPS) traditionnelle. Bien que la SPPS soit une technologie mature, elle présente des inconvénients inhérents tels qu'un coût élevé de la résine, une diminution de l'efficacité de couplage avec l'allongement de la chaîne peptidique et des étapes de purification complexes, notamment pour les peptides longs comme la tirzépatide (39 acides aminés), pour lesquels le rendement global est souvent inférieur à 10 %. La synthèse peptidique en phase liquide (LPPS) permet de s'affranchir de l'utilisation de résine, mais se heurte à des difficultés telles que le contrôle complexe de la solubilité du produit et l'isolement fastidieux des intermédiaires. Bien que des stratégies hybrides SPPS/LPPS aient été décrites ces dernières années, les coûts de production restent élevés. La LPPS assistée par étiquette hydrophobe introduit des étiquettes solubles qui maintiennent la chaîne peptidique en solution dans le milieu réactionnel, permettant une précipitation simple pour la séparation. Cette technique combine les avantages de la synthèse en phase liquide (réaction homogène) avec la facilité de séparation de la synthèse en phase solide. Cette étude est la première à appliquer cette stratégie à la synthèse totale du tirzépatide, dans le but d'établir une voie de synthèse efficace, économique et adaptable à grande échelle.

02 Points forts innovants

Des étiquettes hydrophobes à double fonction permettent un guidage flexible pour la synthèse d'acides/amides C-terminaux : L'équipe de recherche a conçu et synthétisé deux étiquettes hydrophobes à structure modulable, TAGa (type alcool alcoxybenzylique) et TAGb (type lien Rinker), adaptées respectivement à la synthèse d'acides carboxyliques et d'amides C-terminaux. TAGa permet la récupération du produit par simple précipitation à l'acétonitrile, tandis que TAGb peut se lier directement à l'amide de sérine C-terminal de la tirzépatide, évitant ainsi des étapes d'activation supplémentaires. La nature hydrophobe des étiquettes (basée sur une chaîne docosyle) assure une bonne solubilité dans les solvants polaires et une précipitation quantitative dans les solvants non polaires, permettant un cycle « réaction homogène – séparation hétérogène ».

Assemblage segmentaire et stratégie de double protection de la lysine : une approche innovante pour la modification des chaînes latérales. La chaîne peptidique de 39 acides aminés a été divisée en quatre intermédiaires entièrement protégés (7 à 14 acides aminés chacun), simplifiant ainsi la réaction en une seule étape grâce à un couplage itératif. Pour l'étape critique de modification de la chaîne latérale de Lys20, une stratégie de double protection Cbz/Fmoc novatrice a été mise en œuvre : le groupe Fmoc a servi à la déprotection temporaire pour connecter le fragment de chaîne latérale, tandis que le groupe Cbz a été éliminé lors de l'étape finale pour permettre le couplage avec la chaîne principale. Cette conception de protection orthogonale a permis d'éviter les problèmes de coût élevé et de nombreuses réactions secondaires associés au groupe protecteur Alloc traditionnel, améliorant ainsi considérablement la précision de l'assemblage des chaînes latérales.

Déprotection-précipitation en une seule étape pour l'obtention directe d'un produit final de haute pureté : À la fin de la synthèse, le conjugué peptide-étiquette entièrement protégé a été traité directement avec un mélange de TFA contenant 2,5 % de TIS et 2,5 % d'H₂O, permettant la déprotection des chaînes latérales et le clivage de l'étiquette en une seule étape, et favorisant la précipitation du peptide brut. Cette méthode en une seule étape a permis d'éviter de longues étapes de purification chromatographique. Le produit brut, après une simple chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (CLHP-RP), a donné du tirzépatide d'une pureté supérieure à 90 %, améliorant considérablement l'efficacité de la synthèse.

03 Résultats et discussion

3.1 Synthèse et validation des propriétés des étiquettes hydrophobes

L'étude a d'abord synthétisé les deux marqueurs hydrophobes de base, TAGa et TAGb. TAGa est obtenu à partir du benzaldéhyde, par alkylation réductrice pour fixer une chaîne docosyle, donnant une structure d'alcool alcoxybenzylique. TAGb est formé par condensation du benzaldéhyde avec la 2,4-diméthoxybenzylamine, produisant un marqueur amine contenant un lieur Rinker. La caractérisation des propriétés physico-chimiques clés a montré que TAGa et TAGb présentent une solubilité supérieure à 50 mg/mL dans des solvants polaires comme le DMF et le THF, mais précipitent quantitativement (récupération > 95 %) après l'ajout de 4 volumes d'acétonitrile. Ce comportement significatif de commutation de solubilité est à la base du cycle ultérieur de « réaction homogène-séparation hétérogène ».

Schéma 1. Synthèse de TAGa et TAGb

3.2 Synthèse de peptides segmentés et optimisation du couplage guidé par étiquette

La séquence complète de la tirzépatide a été divisée en quatre fragments (intermédiaires I à IV), l'intermédiaire II contenant le site de modification de la chaîne latérale de la lysine 20 (Lys20). Prenons comme exemple la synthèse de l'intermédiaire I par TAGa (Schéma 2) : le Fmoc-Gly-OH a d'abord été couplé à TAGa par catalyse DIC/DMAP. Après précipitation à l'acétonitrile, TAGa-Gly-OH a été obtenu avec un rendement de 92 %. Le groupe Fmoc a ensuite été éliminé par traitement avec 1 % de DBU/pipéridine afin d'exposer le groupe amine, qui a ensuite été couplé à l'acide aminé suivant protégé par Fmoc à l'aide du système HBTU/HOBt/DIPEA. Ce cycle a été répété, permettant la synthèse de l'intermédiaire I contenant 7 acides aminés, avec une efficacité de couplage supérieure à 98 % (contrôlée par HPLC) et une pureté du produit brut supérieure à 85 %.

Figure 2. Stratégies pour la synthèse totale du tirzépatide.

L'intermédiaire IV, avec son amide C-terminal, a posé un défi de synthèse. L'équipe de recherche a d'abord tenté de synthétiser TAG-COOH puis de le coupler au sérinamide C-terminal, mais a échoué en raison d'un encombrement stérique et d'une faible sélectivité du site réactionnel. L'approche finale, couronnée de succès, a consisté à connecter directement TAGb au sérinamide par le groupe amino exposé, permettant ainsi la synthèse de TAGb-intermédiaire IV avec un rendement de 88 % pour cette étape (Schéma 2).

Schéma 2. Synthèse des intermédiaires TAGa et de l'intermédiaire IV

3.3 Assemblage précis de la chaîne latérale : mise en œuvre réussie de la stratégie de double protection

L'intermédiaire II, portant la modification de la chaîne latérale Lys20, était essentiel à la synthèse. Initialement, le groupe Alloc était utilisé pour protéger la chaîne latérale de la Lys, mais la déprotection entraînait des réactions secondaires, visibles en CCM avec des traînées et un noircissement du produit. Pour pallier ce problème, l'équipe a adopté une stratégie innovante de double protection Cbz/Fmoc (Schéma 3). Dans un premier temps, les groupes Cbz et Fmoc ont été introduits simultanément sur la Lys du sous-fragment II-a. Lors d'une première étape, le groupe Fmoc a été sélectivement éliminé par DBU/pipéridine, et le groupe amino ainsi libéré a permis de connecter le fragment de chaîne latérale II-b. Lors d'une seconde étape, le groupe Cbz a été éliminé par hydrogénolyse catalysée par Pd/C, exposant un autre groupe amino pour le couplage avec le fragment de chaîne principale II-c. Cette stratégie a permis une introduction précise de la chaîne latérale, conduisant finalement à l'intermédiaire TAGa-II avec un rendement total de 78 %. L'équipe a tenté d'obtenir l'intermédiaire II-a' par transposition de groupe protecteur, mais sans succès, probablement en raison de la faible réactivité de déprotection du Cbz à cet endroit.

Schéma 3. Synthèse de l'intermédiaire II

3.4 Assemblage complet et caractérisation du produit final

Les quatre fragments ont été connectés séquentiellement par couplage via un marqueur : comme illustré dans le schéma 4, les quatre intermédiaires ont été assemblés en la molécule complète par couplage itératif. Premièrement, après déprotection du groupe Fmoc de l'intermédiaire IV (TAGb), celui-ci a été couplé à l'intermédiaire III (TAGa) dé-marqué pour obtenir l'intermédiaire VI (TAGb). De même, les intermédiaires I et II (TAGa) ont été couplés pour obtenir l'intermédiaire V (TAGa). Enfin, les deux plus grands fragments ont été connectés pour former le conjugué peptide cible-TAG entièrement protégé. Après déprotection avec le mélange TFA/TIS/H₂O, le produit brut a précipité avec un rendement de 78 %. Après purification par HPLC en phase inverse, la tirzépatide de haute pureté a été obtenue sous forme de poudre blanche, confirmant ainsi le succès de la synthèse.

Schéma 4. Synthèse de la tirzépatide

04 Conclusion et perspectives d'avenir

Cette étude a permis de développer avec succès une stratégie de synthèse en phase liquide assistée par un marqueur hydrophobe, aboutissant à la préparation efficace de la tirzépatide. Les avantages de cette méthode sont les suivants : ① La purification par précipitation guidée par le marqueur évite l’utilisation de résine et les séparations chromatographiques fréquentes, réduisant ainsi la consommation de solvant d’environ 40 % ; ② La stratégie de double protection assure l’introduction précise des chaînes latérales, augmentant le rendement global de 2,3 fois par rapport à la synthèse peptidique en phase solide (SPPS) traditionnelle ; ③ La déprotection-précipitation en une seule étape simplifie les opérations finales. À l’avenir, cette méthode est prometteuse pour la synthèse d’autres peptides modifiés (tels que les glycopeptides et les peptides marqués par fluorescence). L’optimisation de la structure du marqueur (par exemple, l’introduction de groupes photolabiles) pourrait permettre une libération contrôlée dans l’espace et le temps. Combinée à des réacteurs à flux continu, elle offre le potentiel d’une production continue de tirzépatide à l’échelle du kilogramme, constituant ainsi un nouveau paradigme pour la fabrication écologique de médicaments peptidiques.

Article original

Pang ZJ, Mao CY, Feng TT, Dong L. Synthèse en phase liquide de tirzépatide assistée par un marqueur hydrophobe. Org Lett. 2025 Sep 19;27(37):10442-10446.

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.orglett.5c03314