Procédés de synthèse courants et recherche d'optimisation des principes actifs pharmaceutiques (API) polypeptidiques

Les procédés de synthèse des principes actifs pharmaceutiques (API) polypeptidiques se divisent principalement en trois catégories : la synthèse peptidique en phase solide (SPPS), la synthèse peptidique en phase liquide (LPPS) et la condensation de fragments. La SPPS est devenue la méthode de choix dans l’industrie pharmaceutique actuelle grâce à sa simplicité de mise en œuvre, son haut degré d’automatisation et son aptitude à la production à grande échelle, représentant plus de 85 % de la production mondiale d’API polypeptidiques. La LPPS est principalement utilisée pour la synthèse de peptides courts (≤ 10 acides aminés) et de peptides à structure particulière. La condensation de fragments est adaptée à la synthèse de peptides à longue chaîne (≥ 30 acides aminés) et de peptides cycliques complexes, et permet de réduire efficacement les erreurs cumulatives et la production d’impuretés lors de la synthèse de peptides à longue chaîne.

1. Synthèse peptidique en phase solide (SPPS) et son optimisation

La synthèse peptidique en phase solide (SPPS) utilise une résine en phase solide comme support pour la construction progressive de chaînes peptidiques par une réaction cyclique de déprotection, d'activation et de couplage. Ses principaux atouts résident dans l'homogénéité du système réactionnel, la facilité de séparation du produit et la possibilité d'une production continue automatisée, répondant ainsi aux exigences des bonnes pratiques de fabrication (BPF) pour la production à grande échelle. Les étapes clés du procédé comprennent le choix de la résine, la sélection des acides aminés protégés, l'optimisation du système de condensation, ainsi que l'optimisation des étapes de clivage et de purification. Chaque étape influe directement sur le rendement et la pureté du produit.

1.1 Optimisation des liens du processus principal

Le choix de la résine doit être adapté à la longueur de la chaîne peptidique et à sa composition en acides aminés. Parmi les résines courantes, on trouve la résine de Wang (adaptée aux peptides C-terminaux carboxylés), la résine Rink amide (adaptée aux peptides C-terminaux amides) et la résine 2-CTC (adaptée à la condensation de fragments). Il est essentiel de porter une attention particulière au coefficient de substitution molaire, au coefficient de gonflement et à la stabilité de la résine afin d'éviter la rupture de la chaîne peptidique due à sa dégradation. La qualité des acides aminés protégés utilisés comme matières premières influe directement sur la qualité du polypeptide final. Il est impératif de contrôler rigoureusement les impuretés telles que les isomères chiraux, les acides aminés incomplètement protégés et les dérivés dipeptidiques. Les acides aminés protégés Fmoc/Boc de haute pureté (≥ 99 %) sont à privilégier. Parmi eux, les acides aminés sujets à la racémisation, tels que l'histidine (His) et la cystéine (Cys), doivent être associés à des groupes protecteurs de chaîne latérale à encombrement stérique (comme le Pmbom et le StBu) afin d'inhiber la formation d'impuretés racémisées.

Le système de condensation est essentiel à l'optimisation du procédé SPPS et nécessite la sélection de réactifs et d'additifs de condensation efficaces et à faible racémisation. Actuellement, l'industrie privilégie les réactifs de condensation à base de sels d'urée de deuxième génération (HATU, HBTU) associés aux additifs HOAt/OxymaPure, permettant de contrôler le taux de racémisation en dessous de 0,1 %. L'utilisation du réactif de condensation de type ynamide de troisième génération (réactif de Zhao) a permis d'obtenir une synthèse sans racémisation (taux de racémisation

Pour le clivage, les réactifs appropriés doivent être sélectionnés en fonction du type de groupe protecteur. Pour le système de protection Fmoc, une solution de clivage au TFA (contenant des agents antioxydants tels que le triisopropylsilane et l'éthanedithiol) est couramment utilisée ; elle permet d'éliminer efficacement les groupes protecteurs des chaînes latérales et de réduire l'oxydation de la chaîne peptidique. Pour le système de protection Boc, le clivage est réalisé par un mélange TFA/acide trifluorométhanesulfonique, et la température et la durée du clivage doivent être strictement contrôlées afin d'éviter l'oxydation d'acides aminés tels que le tryptophane (Trp) et la méthionine (Met). La purification repose principalement sur la chromatographie liquide préparative à haute performance (HPLC). Il est nécessaire d'optimiser la composition de la phase mobile (par exemple, un système acétonitrile-eau-TFA), le gradient d'élution et la quantité d'échantillon injectée afin de garantir une pureté du peptide cible ≥ 98 % et de limiter la formation d'impuretés polymériques pendant la purification.

1.2 Frontières de l'optimisation des processus

Ces dernières années, le procédé SPPS a été modernisé pour devenir plus écologique, automatisé et continu. L'application de la technologie de synthèse sans solvant par broyage à billes permet de réduire de plus de 40 % la consommation de solvants organiques, tout en inhibant la racémisation. Cette technologie est particulièrement adaptée à la production à grande échelle de médicaments à succès tels que le sémaglutide et le liraglutide. La modernisation des synthétiseurs de peptides automatisés permet désormais une déprotection, un couplage et un suivi simplifiés. Associée à la technologie de surveillance UV-AU en ligne, elle permet de contrôler en temps réel les étapes de couplage et de déprotection, réduisant ainsi les erreurs humaines. L'application de la technologie de microréaction en flux continu permet un contrôle précis de la température, de la durée et de la concentration des réactifs, augmentant l'efficacité du couplage en une seule étape à plus de 99 % et réduisant significativement l'accumulation d'impuretés.

2. Synthèse peptidique en phase liquide (LPPS) et son optimisation

La synthèse peptidique en phase liquide (LPPS) utilise une réaction en phase solution pour construire des chaînes peptidiques par couplage étape par étape. Elle convient à la synthèse de peptides courts (tels que les pentapeptides et les hexapeptides) et de peptides hydrophobes sujets à l'agrégation. Ses principaux avantages résident dans une sélectivité de réaction élevée, un contrôle aisé de la pureté du produit et l'absence d'étapes de séparation sur résine. L'optimisation du procédé porte principalement sur le choix du solvant, le contrôle des conditions réactionnelles et la séparation et la purification du produit.

Le solvant doit présenter une polarité modérée et une bonne solubilité pour les acides aminés (par exemple, le DMF, le DCM ou le NMP). Les solvants fortement polaires sont à éviter afin de prévenir l'agrégation des chaînes peptidiques. La température de réaction est contrôlée entre 0 et 5 °C (pour les acides aminés sujets à la racémisation) ou à 25 °C (pour les acides aminés conventionnels) afin de limiter la racémisation et la dégradation des chaînes peptidiques. Pour la réaction de couplage, une stratégie de pré-activation est recommandée : l'acide aminé protégé est pré-activé par le réactif de condensation avant d'être ajouté au milieu réactionnel afin d'améliorer l'efficacité du couplage. La séparation et la purification peuvent être réalisées par extraction, recristallisation ou chromatographie sur colonne. Ces méthodes conviennent à la R&D à petite échelle et à la production de principes actifs polypeptidiques (API) personnalisés. Pour une production à grande échelle, il est nécessaire de combiner ce procédé avec la synthèse peptidique en phase solide (SPPS) afin d'en optimiser les avantages.

3. Procédé de condensation des fragments et son optimisation

Pour les peptides à longue chaîne (≥ 30 acides aminés) et les peptides cycliques complexes, la synthèse peptidique en phase solide (SPPS) classique est sujette à des problèmes tels que l'agrégation de la chaîne peptidique, une diminution de l'efficacité de couplage et l'accumulation d'impuretés. Le procédé de condensation de fragments s'impose comme la solution optimale. Son principe consiste à scinder la longue chaîne peptidique en 2 à 4 fragments peptidiques courts, synthétisés et purifiés respectivement par SPPS/LPPS, puis assemblés en une chaîne peptidique complète par une réaction de condensation. Ce procédé permet de réduire efficacement la pression de la réaction en une seule étape et d'améliorer la pureté du produit final.

L'optimisation du procédé porte principalement sur la sélection des sites de clivage des fragments et le contrôle des conditions de condensation : le clivage des fragments doit éviter les acides aminés sujets à la racémisation (His, Cys) et les régions riches en acides aminés hydrophobes, et privilégier les acides aminés à haute stabilité tels que Gly et Ala ; la réaction de condensation doit utiliser des réactifs efficaces (comme PyBOP, COMU), et la concentration et le pH doivent être contrôlés afin d'éviter l'autopolymérisation des fragments ; la pureté des fragments doit être supérieure à 99 % afin de limiter l'introduction d'impuretés dans le produit final. Ces dernières années, l'application de stratégies de protection orthogonales (comme le système de double protection DNPBS/Fmoc) a permis une déprotection et un couplage précis des fragments, améliorant ainsi l'efficacité et la pureté de la condensation.

4. Exigences de validation et de conformité des processus

La validation du procédé de fabrication des API polypeptidiques doit être conforme aux exigences des BPF, notamment en ce qui concerne la qualification des performances du procédé (PPQ), la validation du nettoyage, la validation des matières premières et les autres étapes. Il est nécessaire de clarifier les paramètres clés du procédé (tels que le temps de couplage, la température, le dosage des réactifs et le gradient de purification) et de les vérifier sur au moins trois lots de production consécutifs afin de garantir la stabilité du procédé. La validation du nettoyage doit définir des limites de résidus raisonnables pour les peptides, les réactifs et les solvants résiduels, et utiliser des méthodes telles que la CLHP-SM pour la détection afin de garantir l'absence de contamination croisée. La validation des matières premières doit couvrir toutes les matières premières, telles que les acides aminés protégés, les résines et les solvants, et établir une norme de qualité complète des matières premières, conformément aux exigences de l'ICH Q11. Parmi celles-ci, les résines ne sont pas recommandées comme matières premières, et des rapports détaillés sur leur provenance et leur qualité doivent être fournis.