De nouveaux éléments constitutifs d'acides aminés à base d'iode hypervalent favorisent la macrocyclisation des peptides

Aujourd'hui, nous partageons une étude importante publiée dans Angewandte Chemie International EditionL'équipe de recherche dirigée par le professeur Jérôme Waser à l'École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), en Suisse, a développé avec succès des blocs de construction d'acides aminés non naturels (NPAA) contenant un noyau éthynylbenziodoxole (EBx). Ces blocs (par exemple, Fmoc-Lys(EBx)-OH) sont entièrement compatibles avec la synthèse peptidique en phase solide (SPPS) et en phase liquide (SPS). Ils permettent l'insertion précise et spécifique du groupement EBx hautement réactif à n'importe quelle position désignée au sein d'une chaîne peptidique complexe contenant plusieurs résidus identiques (par exemple, plusieurs lysines). Grâce à ces blocs, les chercheurs ont réalisé diverses réactions de macrocyclisation peptidique efficaces et douces, synthétisant avec succès des peptides monocycliques et bicycliques structurellement uniques et topologiquement diversifiés, élargissant ainsi considérablement la boîte à outils des chimistes pour la construction de banques de peptides cycliques.

01 Contexte de la recherche

La macrocyclisation peptidique est une stratégie clé pour améliorer la stabilité métabolique, l'affinité de liaison et l'activité biologique. Cependant, obtenir une cyclisation chimiosélective et site-sélective sur une chaîne peptidique non protégée contenant plusieurs résidus réactifs identiques (par exemple, lysine, cystéine) est extrêmement complexe. Une solution courante consiste à introduire une paire d'acides aminés non naturels portant des groupements réactifs complémentaires (par exemple, alcyne-azide, alcène-alcène) pour la cyclisation par chimie click, mais cette approche limite les combinaisons d'acides aminés disponibles et la diversité structurale. Une autre stratégie consiste à introduire un groupement réactif unique qui réagit avec un résidu natif de la chaîne peptidique. Toutefois, les méthodes existantes (par exemple, utilisant des acrylates ou des halogénures d'aryle) nécessitent souvent des conditions drastiques (base forte, température élevée) ou l'utilisation de peptides protégés, ce qui limite leur applicabilité. Par conséquent, il existe un besoin urgent, dans le domaine de la découverte de médicaments peptidiques cycliques, de nouvelles méthodes permettant d'introduire avec précision un groupement réactif unique, hautement efficace et bioorthogonal à une position spécifique d'une chaîne peptidique, dans des conditions douces et faciles d'utilisation. Les réactifs à base d'iode hypervalent, grâce à leur faible toxicité, leur réactivité et leur sélectivité élevées, présentent un potentiel pour la modification des peptides. Parmi eux, les réactifs éthynylbenziodoxolone (EBX) ont été utilisés pour l'alcynylation des peptides. Cependant, les tentatives précédentes d'incorporation de ces réactifs comme éléments constitutifs dans les chaînes peptidiques se sont heurtées à l'obstacle majeur de leur instabilité dans les conditions acido-basiques drastiques de la synthèse peptidique en phase solide (SPPS).

02 Points forts innovants

Transformation réussie d'EBX instable en blocs constitutifs d'acides aminés EBx stables

L'équipe de recherche a abandonné le noyau EBX classique contenant un groupe carbonyle et lui a préféré un noyau éthynylbenziodoxole (EBx) trifluorométhylé, plus stable. Par amidation sélective de son ester actif avec l'amine libre de la lysine, de l'ornithine ou de l'acide 2,4-diaminobutyrique protégés par Fmoc, disponibles dans le commerce, elle a synthétisé avec succès, à l'échelle du gramme, des blocs de construction d'acides aminés non naturels tels que Fmoc-Lys/Orn/Dap(EBx)-OH. La clé de cette conception réside dans le fait que le noyau EBx conserve une réactivité élevée, nécessaire à la synthèse et à la cyclisation peptidiques ultérieures, tout en présentant la stabilité requise.

Première démonstration de la tolérance du noyau EBx au flux de travail complet SPPS/SPS

Il s'agit là d'une des avancées majeures de cette étude. La recherche confirme que les blocs de construction d'acides aminés EBx développés sont parfaitement compatibles avec les multiples cycles de déprotection et de couplage de la synthèse peptidique en phase solide Fmoc (Fmoc-SPPS) standard. Même lorsque le bloc EBx est inséré au milieu d'une chaîne peptidique et soumis à jusqu'à 10 cycles de synthèse (soit 23 étapes chimiques au total), le peptide cible-EBx peut être obtenu avec des rendements acceptables (5 à 13 %), contre 25 % pour le peptide témoin sans EBx. Par ailleurs, ce bloc de construction convient également à la synthèse peptidique en phase liquide et résiste à des conditions telles que la déprotection du groupe Boc (TFA) et l'hydrolyse des esters (LiOH).

Obtention d'une fonctionnalisation précise des substrats de polyamine

Grâce à la spécificité de site de la synthèse peptidique en phase solide (SPPS), le groupement EBx peut être introduit avec précision sur n'importe quelle lysine ou amine N-terminale désignée de la chaîne peptidique. Même en présence de plusieurs lysines, une modification spécifique à une position unique est possible (par exemple, pour les peptides). 4D, 4iCela permet de surmonter les problèmes de faible sélectivité associés à la modification en fin de processus des substrats de polyamine à l'aide de réactifs EBx bifonctionnels, offrant une précision de contrôle inégalée.

Stratégies novatrices de cyclage et d'agrafage multiples basées sur une seule poignée EBx

Les intermédiaires peptide-EBx obtenus peuvent utiliser le noyau EBx comme un groupement réactif polyvalent. Ce dernier réagit avec différents résidus natifs de la chaîne peptidique (par exemple, amine libre, cystéine, cycle indole du tryptophane) dans des conditions douces. Ceci permet divers modes de cyclisation tels que la lactamisation, la cyclisation par pontage Cys-Lys et l'alcynylation/cyclisation de la liaison CH du Trp. La plateforme permet de construire efficacement des peptides monocycliques, bicycliques et pontés présentant différentes topologies, y compris un peptide de 18 acides aminés, démontrant ainsi son fort potentiel pour la création de peptides cycliques structurellement diversifiés.

03 Résultats et discussion

3.1 Préparation à l'échelle du gramme des blocs constitutifs d'acides aminés EBx

Utilisation du réactif bifonctionnel EBx 2a(portant un ester actif) et des acides aminés Fmoc commerciaux, synthèses à l'échelle du gramme de Fmoc-Lys(EBx)-OH (3a), Fmoc-Orn(EBx)-OH (3b), et Fmoc-Dap(EBx)-OH (3cCes composés ont été obtenus avec succès par de simples réactions d'amidation. Les produits ont été obtenus avec une pureté supérieure à 77 % (HPLC), sans purification par chromatographie sur colonne, par simple extraction et lyophilisation, démontrant ainsi la faisabilité de la méthode à l'échelle préparative.

3.2 Validation de la large compatibilité dans la synthèse peptidique en phase solide

Utilisation de blocs de construction 3aDans la SPPS, une série de dérivés peptide-EBx (4a-4o) ont été synthétisés avec succès. Les résultats ont prouvé que le noyau EBx tolère diverses chaînes latérales d'acides aminés (acide libre, amine, amide, histidine, tryptophane, tyrosine, etc.). Surtout, il permet une modification sélective : par exemple, dans un hexapeptide contenant deux lysines, seule la lysine spécifiée a été modifiée (4D); il a également permis la modification sélective d'une lysine spécifique dans le peptide Substance P de 11 acides aminés en présence d'une extrémité N-terminale libre (4 lMême en plaçant l'EBx à l'extrémité C-terminale, ce qui nécessite 10 cycles de synthèse, le produit (4o) a été obtenu avec succès, démontrant ainsi son excellente stabilité.

3.3 Application à la synthèse peptidique en phase solution

Boc-Lys(EBx)-OMe (5) a été synthétisé avec succès. En utilisant à la fois les stratégies C-à-N (déprotection Boc avec TFA suivie d'un couplage) et N-à-C (hydrolyse de l'ester avec LiOH suivie d'un couplage), les produits dipeptidiques (6a, 6b, 7a, 7bLes composés ont été obtenus avec de bons rendements (45 à 60 % en deux étapes). La synthèse peptidique en phase solide (SPS) a pu être réalisée à l'échelle de 100 micromoles en utilisant seulement 1,05 équivalent de l'acide aminé EBx, démontrant ainsi sa faisabilité pour une synthèse à plus grande échelle.

3.4 Réactions de cyclisation multimodales et applications

Lactamisation :À partir d'un peptide linéaire 4t, contenant des extrémités N- et C-terminales libres et une Lys(EBx), une lactamisation intramoléculaire s'est produite en milieu basique, donnant un peptide cyclique 8aavec un rendement de 29 % par synthèse peptidique en phase solide (SPPS). Sa structure ressemble à celle du produit naturel pseudostellarine G.

Agrafage Cys-Lys « inversé » :Contrairement aux méthodes traditionnelles (où un réactif EBx modifie la cystéine, qui attaque ensuite la lysine), cette étude a préinstallé l'EBx sur un hexapeptide de lysine désigné. 4uAprès clivage de la résine et dans des conditions basiques douces, une attaque intramoléculaire de la Cys sur la Lys(EBx) a été réalisée avec succès, donnant un peptide cyclique agrafé. 8bPlus impressionnant encore, dans un peptide en hélice α de 18 résidus, l'installation sélective d'EBx sur la Lys en position i+5 a permis un agrafage spécifique avec la Cys en position i (8c), subvertissant la préférence d'agrafage i/i+4 inhérente à cette séquence.

Synthèse de peptides bicycliques par agrafage formel Lys-Lys :L'alcynylation de la liaison C2-H du tryptophane catalysée par l'or permet d'utiliser le groupement EBx dans le peptide. 4Va subi une cyclisation avec l'amine libre d'une autre Lys intramoléculaire, donnant 8dDe plus, à partir de 4w, un peptide bicyclique 8ea été construit efficacement en deux étapes (rendement de 38 %) via une cyclisation initiale d'alcynylation C2 du Trp intramoléculaire, suivie d'une lactamisation N-à-C.

Construction d'une bibliothèque diversifiée de peptides cycliques :À partir du même squelette peptidique de 11 peptides, en installant le groupement EBx à différentes positions (Trp, Lys, Orn, Dap) et en effectuant une cyclisation catalysée par l'or avec un autre résidu Lys ou Trp intramoléculaire, on obtient des peptides cycliques 8f-8iDes structures présentant différentes connectivités et topologies ont été construites avec succès. Ceci démontre la capacité de la plateforme à générer des banques de peptides cycliques structurellement diversifiées.

04 Conclusion et perspectives d'avenir

Cette étude a permis de développer avec succès une classe de blocs de construction d'acides aminés non naturels contenant un noyau d'iode hypervalent stable (EBx) et a démontré de manière systématique leur excellente compatibilité avec la synthèse peptidique en phase solide et en phase liquide. L'avantage principal de cette stratégie réside dans la possibilité d'installer avec précision et de manière site-spécifique un groupement EBx unique et hautement réactif à n'importe quelle position désignée au sein de séquences peptidiques complexes. S'appuyant sur ce résultat, les chercheurs ont développé diverses méthodes de cyclisation douces et efficaces pour la construction de peptides monocycliques et bicycliques structurellement et topologiquement diversifiés, résolvant ainsi les principaux problèmes des méthodes de cyclisation traditionnelles, tels que la difficulté de contrôle du site, les conditions drastiques et la diversité limitée.

L'importance majeure de ce travail réside dans la transformation d'un réactif d'iode hypervalent, initialement jugé trop réactif et difficile à intégrer dans des flux de travail de synthèse multi-étapes, en un élément de construction synthétique robuste et fiable grâce à une conception moléculaire rationnelle. Il ne s'agit pas simplement d'un outil de cyclisation supplémentaire, mais d'un nouveau paradigme de « pré-installation d'une poignée réactive universelle » pour la fonctionnalisation et la cyclisation modulaires des peptides. À l'avenir, cette plateforme devrait avoir un impact plus important dans les directions suivantes : ① Optimisation plus poussée de la structure du noyau EBx afin d'améliorer sa stabilité lors de la synthèse de chaînes peptidiques ultra-longues ; ② Application de ces peptides EBx à la modification site-spécifique et à la bioconjugaison de protéines ; ③ Intégration avec des technologies de criblage à très haut débit, telles que les banques de peptides codées génétiquement et le mRNA display, pour la construction et le criblage rapides de banques de peptides macrocycliques basées sur la cyclisation EBx, en vue de la découverte de nouveaux composés candidats ciblant des cibles « inaccessibles aux médicaments ». En résumé, ce travail offre aux chimistes et aux biologistes chimistes un outil puissant et flexible, faisant progresser de manière significative les domaines de la chimie de synthèse des peptides cycliques et de la découverte de médicaments.

Article original : Liu, Xing‐Yu, et al. « Blocs de construction d’acides aminés à l’iode hypervalent pour la macrocyclisation de peptides bioorthogonaux ».Angewandte Chemie International Edition63.33 (2024) : e202404747.